第六章重组体的筛选与鉴定总结VIP免费

第六章重组体的筛选与鉴定将目的基因与载体连接形成重组子,然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞,得到所需要的带有重组DNA的转化子是基因工程的目的所在.何谓转化子?所谓转化子就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞.为什么对重组子要进行鉴定筛选?在转化反应中,并非所有的细胞中都转入重组DNA分子,即使所有的受体细胞都变为转化体,所获得的转化子仍是多种类型的DNA分子,原因是在连接反应中会有以下几种情况发生:•载体和一个或数个串联目的基因连接•载体发生自连•目的DNA分子发生自连•未发生连接反应的载体和目的DNA片段(更多)为什么对重组子要进行鉴定筛选?因此,在成千上万个转化子中，真正含有期望的重组DNA分子的比例很少，为了将含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA的宿主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主细胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开，就需要设计出最易于筛选重组子克隆的方案并加以验证。常用的重组子筛选和鉴定方法•重组子大小的鉴定(质粒DNA的快速提取鉴定)•重组子酶切图谱鉴定(限制性核酸酶酶切片段大小鉴定)•DNA序列分析•同源性分析鉴定(原位杂交)•质粒载体的抗性标记筛选•噬菌体包装容量的正性筛选•质粒载体的α互补筛选(蓝白色斑筛选法)•标记补救筛选•翻译产物(Westernblot)•转录产物(Northerblot)•其他方法(报告基因)DNA鉴定载体筛选直接筛选间接筛选重组子的筛选第一节遗传学检测法一、根据载体表型特征的筛选根据载体分子所提供的表型特征,选择重组体DNA分子的遗传选择法,可适用于大量群体的筛选,因此是一种比较简单而又十分有效的方法。在基因工程中使用的所有载体分子,都至少含有一个选择标记。质粒常有抗生素抗性基因,如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）、卡那霉素抗性基因（Kanr）根据载体分子所提供的选择性标记进行筛选,是获得重组体DNA分子必不可少的条件之一。在实际操作中,最典型的方法是使用抗药性标记的插入失活作用,或是β-半乳糖苷酶基因的显色反应,将重组体DNA分子的转化子同非重组的载体转化子区别开来.而对于λ噬菌体的置换型载体来说,λ噬菌体头部外壳蛋白容纳DNA的能力是有一定限度的。其包装能力应控制在野生型λDNA长度的75%-105%之间（36-51kb），这样才能形成噬菌斑。因此，包装限制这一特性，保证了体外重组所形成的有活性的λ重组体分子，一般都应带有外源DNA的插入片段，噬菌斑的形成本身就是λ重组体的一种筛选特征。由于这些方法都是直接从平板上筛选，所以又称为平板筛选法。一、根据载体表型特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。1.以pBR322质粒为例（1）pBR322质粒的一般特性在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别位点。一、根据载体表型特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法1.以pBR322质粒为例（2）筛选重组体的原理在Ampr和Tetr这两个基因内的任一插入作用，都会导致Ampr基因或Tetr基因出现功能性失活，于是，所形成的重组质粒都将具有AmpsTetr或Amprtets的表型。当外源DNA片段插入pBR322质粒DNA的BamHⅠ或SalⅠ位点时，抗四环素基因失活（TetrTets），重组体转化子必定具有AmprTets表型。因此，将转化菌先涂布在含有Amp的琼脂平板上，并将存活的Ampr菌落原位影印到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Amp平板上生长，而不在Tet平板上生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA片段的重组质粒转化子克隆.如下图所示同样,在pBR322质粒的Ampr基因序列中,利用PstⅠ限制性核酸内切酶识别位点,插入外源DNA片段,也能应用插入失活作用检测重组质粒,当然,所挑选的菌落就应该是具有AmpsTetr的表型一、根据载体表特征的筛选（一）抗药性标记插入失活筛选法pBR322pBR322pBR322AmprTetrAmprTetrAmprTets+菌落原位影印Amp琼脂平板Tet琼脂平板图应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体一、根据载体表特征的筛选（二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法1.乳糖操纵子的结构阻遏蛋白β-半乳糖苷酶β-半...