1 第一章 多肽和蛋白质的反相HPLC分析与纯化 反相高效液相色谱（RP-HPLC）已经成为一种分析和纯化生物分子广泛而可靠的方法。RP-HPLC在肽、蛋白质分析和纯化方面的重要作用在于它的分离度：RP-HPLC能够分离具有几乎同样序列的多肽，这不仅包括那些胰岛素消化物中的小肽，还包括更大的肽。仅相差一个氨基酸残基的多肽通常可以用RP-HPLC分离，如图1所示的胰岛素变异物的分离。胰岛素变异物的分子量都在5300左右,只是在氨基酸序列上有轻微的不同，即使这样，大部分的变异物都可以用RP-HPLC分离。特别的是，反相色谱能分离人和兔的胰岛素，两者仅在于一个亚甲基的不同——兔胰岛素有一个苏氨酸，而人胰岛素有一个丝氨酸！ RP-HPLC对相近胰岛素变异物的分离 图1.RP-HPLC分离含有一个不同氨基酸的人和兔胰岛素。色谱柱：VYDAC 214TP54 洗脱液：27-30%ACN+0.1%TFA，1.5mL/min，25min。 科学文献中已有很多用RP-HPLC分离相似多肽的例子。含有一个氧化蛋氨酸的胰岛素样生长因子与其未氧化态类似物已得到分离，白细胞介素-2突变蛋白也已经得到分离。在最近的论文中，Kunitani及其同事提出，RP-HPLC的保留时间能提供保留在反相表面的蛋白质的结构信息。他们研究了 30种白细胞介素-2 突变蛋白，并分离了几乎相同的突变蛋白。含氧化蛋氨酸的白介素与其自然状态得到分离，另外，单个氨基酸取代基也被与其自然状态分离。他们得出结论：蛋白质的结构在反相分离中非常重要，同时，RP-HPLC也能用来研究蛋白质的结构。在该过程中，他们展示了 RP-HPLC技术对相似多肽的分离能力。 RP-HPLC用于分离酶消化产物中的肽碎片，纯化天然肽及合成肽。制备 RP-HPLC常常用于纯化克及毫克量的合成肽。RP-HPLC能用于分离血红蛋白变体，鉴别微粒种类，研究酶亚基和细胞功能。RP-HPLC还能纯化用于序列测定的微量级肽，并纯化治疗用的毫克级到千克级生物技术衍生多肽。 反相HPLC广泛用于生物制药领域的蛋白质治疗制品的分析。通过分析蛋白质治疗制品的酶消化物能识别蛋白质，并检测基因变化与蛋白质降解（脱酰氨和氧化）产物。用RP-HPLC分析完整蛋白质，能验证蛋白质的结构并测定降解产物。随着生物技术革命的扩展，该色谱技术的应用也随之扩大。在过去的几年中，仅涉及 VYDAC反相色谱柱方面的专利数目就已呈现指数级的增长，如图2（又见参考资料 74）。 2 用Grace Vydac反相HPLC色谱柱发表的专利数 图2。美国专利局公布的1984-2000年间在专利中使用VYDAC®反相HPL...
