实验四酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimunosorbentassay,ELISA)抗原-抗体反反应的类型凝集反应（agglutination)沉淀反应(precipitation)补体结合实验中和实验免疫酶标技术(eg.ELISA)免疫荧光技术放射免疫技术发光免疫技术经典的反应现代的反应抗原抗体反应类型免疫标记技术免疫标记技术免疫标记技术：即用酶、同位素、荧光素、胶体金、发光物质等标记物作为追踪和放大物，标记抗体或抗原，进行的抗原抗体反应。免疫标记技术具有灵敏度和特异性高、快速，可定性、定量、定位检测的优点，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。免疫标记技术的种类•免疫荧光技术(Immunoflurescencetechnique）•免疫酶技术(Immunoenzymatictechnique)•同位素标记技术(Isotopelabellingtechnique)•免疫胶体金技术(Immunogoldstaining)•免疫发光分析(Luminescentimmunoassay)Actin免疫荧光染色（cy3标记）FITC-细胞桨；DAPI-细胞核SYBRGreenI溶液染色：病毒（小点）、细菌（大亮点）、硅藻（细长的细胞）SYBRGreenI凝胶染色染色体原位杂交检测免疫荧光染色，多色叠加•免疫酶标技术：用酶标记的已知抗原（或抗体）来检测未知的抗体（或抗原）的一种免疫学标记技术。它同时利用了酶的高效催化效能及Ag-Ab反应的高度特异性；据底物被酶分解后的显色及深浅可反映待测样品中Ag、Ab的有无与含量；•可分为酶联免疫吸附试验和酶免疫组化技术常用于标记的酶•常用的酶辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,ALP)葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。•Note:最好在受检标本中不存在相同的酶。Return>>OPD•OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，显色由橙红色转向棕黄色。在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。•OPD本身难溶于水，见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。TMB•TMB经HRP作用后产物显蓝色，目视对比鲜明。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。•TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。•TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。•原理：–以酶标抗体与组织或细胞的抗原进行反应，结合形态学检查，对抗原进行定性、定量或定位的检测技术。该方法主要用于检测组织或细胞表面的抗原。–常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP)；其底物为二氨基联苯胺(DAB)，可生成棕褐色沉淀物，使玻片标本上抗原所在部位呈色。免疫酶组化技术免疫酶组化技术（（immunohistochemistryimmunohistochemistrytechniquetechnique））是固相吸附技术与免疫酶技术的结合，具有特异性高、敏感性强、稳定性好、操作简便等优点，是当前应用最广的一类酶免疫测定法。其中固相免疫技术即将已知的抗原或抗体用物理方法吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用于检测可溶性的抗原或抗体。ELISA（酶联免疫吸附试验）间接法双抗夹心法抗原竞争法间接法双抗体夹心法抗原竞争法包被物AgAbAb酶标物Ab2(抗抗体)AbAg待测物Ab1(一抗)多价大分子抗原抗原、半抗原、抗体原理与方法双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）示意图固相载体抗体抗原酶抗体酶标记抗体1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。操作步骤（双抗体夹心法检测HBsAg）包被：羊抗HBsIgG(一抗）。（已完成）抗原抗体反应：加阳性、阴性、被检血清（100μl/well），37℃，30min。加酶标抗体（100μl/well），进行抗原抗体反应。37℃，30min酶促反应：加底物TMB（100μl/well），10.min显色。终止反应：50μl/well2M硫酸。洗涤洗涤•原理：–以酶标抗体与组织或细胞的抗原进行反应，结合形态学检查，对抗原进行定性、定量或定位的检测技术。该方法主要用于检测组织或细胞表面的抗原。–常用的酶是辣根过氧化物酶(HRP)；其底物为二氨基联苯胺(DAB)，可生成棕褐色沉淀物，使玻片标本上抗原所在部位呈色。免疫酶组化技术免疫...
