文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。二、质粒DNA分离的基本步骤：细菌培养物的生长、细菌的收获和裂解、抽提、纯化质粒DNA。关键步骤：宿主细胞的裂解文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。三、质粒DNA分离的方法：碱裂解法、煮沸法、去污剂裂解法碱裂解法、煮沸法---较剧烈去污剂裂解法----较温和，适用于分离大质粒文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。一、实验目的碱裂解法提取质粒DNA文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。二、原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。三、试剂１.溶液Ⅰ50mM葡萄糖,25mMTris-HCl(pH8.0)10mMEDTA(pH8.0),高压灭菌，4℃保存２.溶液II0.2MNaOH,1%SDS,现配现用３.溶液III5MKAC60ml,11.5冰乙酸，28.5水，4℃保存４.3MNaACpH5.2高压灭菌，4℃保存５.氨苄青霉素50mg/ml,６.溶菌酶７.酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)８.异丙醇９.LB培养基10.电泳试剂见附11.TE缓冲液文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。四、仪器与材料：超级恒温器或恒温水浴、冷冻离心机、培养箱、摇床、微量取液器、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统Eppendorf管文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。五、操作流程：细菌培养离心收集细菌裂解细菌收集质粒抽提纯化质粒DNA电泳检测文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。五、操作步骤：一）细菌培养和质粒的扩增二）裂解细菌、收集质粒DNA1）离心收集细菌2）裂解细菌3）收集质粒三）抽提质粒、分离纯化1）柱层析2）洗脱3）收集质粒、保存文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。五、操作步骤：一）细菌培养和质粒的扩增从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到LB培养基中培养。培养数小时后，加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行扩增。氯霉素：抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。二）裂解细菌、收集质粒DNA1）离心收集细菌取1.5ml菌液室温下5000g离心1min弃上清再加1.5ml菌液室温下5000g，离心1min弃尽上清、回收菌体（再重复1次）文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2）裂解细菌：加250μl溶液Ⅰ混悬菌体收集的菌体强烈振荡充分混匀，无可见菌块溶液Ⅰ：含50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)RNase溶液Ⅰ葡萄糖:能增加溶液的黏度，防止DNA受机械剪切。EDTA:螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,1)抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用；2)同时又有利于溶菌酶的作用。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2）裂解细菌：加250μl溶液Ⅰ溶液Ⅱ：含0.2mol/LNaOH，1%SDS用时新鲜配制加入250μl溶液Ⅱ混悬菌体收集的菌体强烈振荡混匀温和颠倒5次溶液ⅡSDS是离...
