Western_blot的原理、操作及注意事项(经过真实的实验)VIP免费

Western blot 的原理、操作及注意事项 （经过真实的实验） 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3 倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml 加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml 加入0.5ml）煮沸 10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞： 细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml 加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml 加入0.5ml）煮沸 10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例）： 直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。 B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1.双缩脲 法： 双缩脲 法是 第 一个 用比 色 法测定蛋白质浓 度 的方法。在 需 要 快 速 ，但 不很 准 确 的测定中，常 用此 法。硫 铵 不干 扰 显 色 ，这 对蛋白质提纯 的早 期 阶 段 是 非 常 有 利 的。双缩脲 法的原理是Cu2+与 蛋白质的肽 键 ，以 及酪 氨 酸 残 基 络 合，形 成 紫 蓝色 络 合物，此 物在 540nm 波长 处有 最大吸 收。双缩脲 法常 用于0.5g/L～10g/L 含 量的蛋白质溶液测定。干 扰 物有 硫 醇 ，以 及具 有肽 性质缓 冲 液，如Tris、Good 缓 冲 液等。可用沉 淀 法除 去 干 扰 物，即 用等体积10%冷的三氯 醋 酸 沉 淀 蛋白质，然 后弃 去 上清液，再 用已 知 体积的1m NaOH 溶解沉 淀 的蛋白质进行定量测定。 2.Lowry 法： 此 法是 双缩脲 法的进一步 发 展 。他 的第 一步 就 是 双缩脲 反 应 ，即Cu++与 蛋白质在 碱 性溶液中形 成 络 合物，然 后这 个 络 合物还 原磷 钼 磷 -磷 钨 酸 试剂（福 林 -酚试剂），结果 得 到深蓝色 物。此 法比 双缩脲 法灵 敏得 多，适 合于测定20mg/L～400mg/L 含 量的蛋白质溶液。其 ...