PCR扩增原理及过程VIP免费

第八章：PCR技术及应用PCR技术是模拟体内DNA复制的的方式，在体外选择性的将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。其过程与普通DNA复制一样有三个步骤，首先是模板DNA变性，由双链状态变成单链状态;然后引物与模板结合，完成复制过程；最后在DNA聚合酶和底物存在情况下合成与模板互补的DNA。第一节PCR技术原理和工作方式•一、PCR的基本原理•1、基本要素和扩增原理•DNA的复制是生命活动中最基本的过程之一，PCR的基本原理离不开DNA复制的基本规律。在PCR过程中模板可以是双链DNA也可是单链DNA，最后扩增出来的是双链状态的。其中引物是DNA复制中不可缺少的。•与单纯的DNA复制不同的是，PCR扩增总是在两个引物的存在下对DNA的两条链同时进行复制，复制的结果得到一条双链DNA。通过仪器的自动控制，使这样的DNA复制重复进行，从而得到大量的位于两个引物之间的DNA片段，即目的片段。前一轮扩增得到的DNA产物可做下一轮扩增的模板，扩增产物以几何级别递增。•2、PCR扩增的步骤首先将模板DNA置于92~96度进行变性处理，使双链DNA在高温下解链成为单链DNA此时的温度称为解链温度Tm，且热变性不改变其化学性质；染后退火，将温度降至37~72度，使引物与模板的互补区结合，最后在72度条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3’羟基端合成DNA这个步骤称为延伸。这三个热反应过程的重复性称为一个循环经过20~40个循环可扩增得到大量位于两条引物序列之间的DNA片段。Tm(meltingtemperature)：50%DNA分子变性时温度称为熔解温度/解链温度。一般生理条件下，Tm在85-95℃℃之间。影响Tm值的因素：（G+C）含量增加，Tm值增高溶液的离子强度高，则Tm增加（离子键的形成增多）；甲酰胺的浓度增加，则Tm下降（使碱基对间的氢键不稳定，可避免G、C含量高的DNA在高温变性时引起断裂而失活）；若DNA组成比较单一，则变性发生在狭窄的温度范围内.二、PCR反应体系PCR反应需要在一定的条件下才能完成，只有这些条件协调作用时才能达到很好的效果。1、缓冲液2、脱氧三磷酸核苷（dNTP）3、引物4、模板5、DNA聚合酶1、缓冲液：缓冲液除了提供pH缓冲能力外，还有一些辅助反应进行的成分，主要是Mg2+。Mg2+浓度的高低会影响扩增的特异性和产率，直接影响扩增的成败，最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同。为了确定最佳浓度,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。2、脱氧三磷酸核苷（dNTP）脱氧三磷酸核苷是DNA合成的底物，高浓度dNTP易产生错误掺入；但浓度过低，将降低反应产物的产量。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。PCR中常用终浓度为200μM的dNTP3、模板模板是将要被复制的核酸片段DNA或RNA，因此模板是PCR的关键，模板的质量是PCR成功的先决条件，一般要有较高的纯度，最好用纯化的DNA样品，（粗品应避免混有蛋白酶、核酸酶）。另外模板的数量也会直接影响扩增的效果，一般要求含量合适，310ⅹ5分子数（1μg）（提高产量，减少非特异性扩增）；4、DNA聚合酶PCR反应中使用的DNA聚合酶是耐高温的，在90度以上的高温下仍能有活性。也正是高温DNA聚合酶的应用才使得PCR技术得以推广。选择聚合酶要从实验的具体要求考虑，高保真的酶成本较高，只有要求严格时选用。TaqDNA聚合酶被看做是低保真度的聚合酶，因为其缺少3‘到5’外切核酸酶（校正）活性，但是产量高，是目前实验室应用最多的酶。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高保真度。但是这些聚合酶的产量比TaqDNA聚合酶低。(1)TaqDNA聚合酶是目前实验室PCR中应用最多的酶。具有5’到3’合成活性和5’到3’外切酶活性，但无3’到5’外切酶活性。在95度的半衰期为40分钟。由于没有3’到5’外切酶活性，在扩增中有8.9×10-5~~1.1×10-4的错配率。•（2）TthDNA聚合酶来自嗜热热细菌HB8在74度下进行扩增Mg+存在条件下，以DNA为模板合成DNA，Mncl2存在下可以RNA为模板合成cDNA。•（3）VentDNA聚合酶•（4）pwoDNA聚合酶是使用较多具有3’到5’外切酶活性且具有高保真度的P...