1 Ann exin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸 (PS) 由质膜内侧翻向外侧。 Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与 DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以 Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如 PI 或 7-AAD) 合并使用，来区分凋亡细胞 (Annexin V+/ 核酸染料 -) 与死亡细胞(Annexin V+/ 核酸染料 +)。实验用品1. 一次性 12 75mm Falcon 试管。2. PBS缓冲液：含 0.1%NaN 3，过滤后 2-8 C保存。3. 微量加样器和加样头。2 4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（ Cat. No. 66121E ）：浓度为10 ，使用时，用稀释为 1 浓度的应用液。5. Annexin V 试剂与核酸染料：Annexin V 核酸染料Annexin V-Biotin （Cat. No. 65872X ）Streptavidin-FITC （Cat. No. 13024D ）PI（Cat. No. 66211E ）或7-AAD （Cat. No. 34321X ）Annexin V-FITC （Cat. No. 65874X ）PI（Cat. No. 66211E ）Annexin V-PE （Cat. No. 65875X ）7-AAD （Cat. No. 34321X ）6. FACS 流式细胞仪：上样检测。7. CELLQuest 软件：获取和分析试验数据。8. Annexin V 检测对照管：Annexin V A-阴性对照B-补偿 1 C-补偿 2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和 SAv-FITC PI 和SAv-FITC PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI 操作步骤1.取 Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。2.使用冷的 PBS缓冲液洗细胞两次，再用1Binding Buffer 缓冲液制成 1 10 6细胞/ml的悬液。3.Falcon 试管中加入 100 μl细胞悬液。4.按以下体积加入 Annexin V 与核酸染料：管号名称荧光标记Annexin V 核酸染料：1阴性对照--2单阳 1 AV-FITC -3单阳 2 -PI 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀，室温（ 20 C ~25 C）避光处放置 15分钟。
