中国人群运动性猝死相关基因快速检测方法研究样本

下载后可任意编辑中国人群运动性猝死相关基因快速检测方法讨论摘要 目的:建立一种中国人群运动性猝死相关基因多态性速测方法。方法:用Chelex法提取外周静脉血基因组DNA, 应用定点突变技术获得运动性猝死相关基因的突变阳性DNA模板, 然后经过等位基因特异性PCR法扩增目的基因。优化内参引物、 多态引物的Tm值, 引物浓度比例, PCR循环数等扩增条件; 琼脂糖凝胶电泳进行基因分型。结果:AS-PCR可检测运动性猝死相关基因多态性, PCR产物琼脂糖凝胶分型与DNA测序结果完全一致。 结论:本讨论建立的AS-PCR方法适用于中国人群运动性猝死相关基因的快速检测。关键词 运动性猝死; 基因多态性; 等位基因特异性PCR中图分类号 G804.83近年来, 高强度竞技体育运动项目动性猝死案例频发, 而且其数量呈逐年上升的态势。当前, 临床对运动性猝死的常规检测手段主要有家族史、 个人史筛查, 体格及心电图检查, 若为阳性结果, 则进一步查超声心动图、 运动负荷试验和 24 小时动态心电图等[1]。但这些检测方法针对性不强, 检出率低, 具有较大的局限性。国内外对运动性猝死的讨论表明[2], 死者的某些基因存在突变, 大多表现为 SNP 或碱基缺失多态性。本讨论选取 KCNH2、 KCNE1、 SCN5A、 KCNJ11、 NUP155、 CACNA1C、 CACNB2b, 7 个与运动性猝死显著相关的热点突变基因的多态位点作为靶点, 以 AS-PCR 方法为检测手段, 从而建立准确、 快速筛查运动性猝死基因多态性的方法。1. 材料与方法1.1 主要试剂及仪器 Chelex-100 购自上海生物工程公司; 定点突变试剂盒 MutanBEST Kit , PMD18—T Vector , PCR 扩增试剂包括 TaKaRa Taq™ Hot Start DNA 热启动 Taq酶, dNTPs,Buff 以及核酸电泳分析试剂 DL1000 DNA 分子量标准, DNA 无毒染料, 琼脂糖,均购自日本 Takara 公司; Bigdye3.1 DAN 测序试剂盒,购自美国 Life下载后可任意编辑公司。主要仪器设备有: 美国 ABI9700 型 PCR 扩增仪, 英国 UVR 电泳凝胶成像系统, 美国 ABI3130 型 DNA 测序仪。1.2 基因组 DNA 提取 50 例猝死个体临床血液样本, 采纳 Chelex 基因组 DNA 提取试剂盒, 参照使用说明书操作, 提取基因组 DNA。取直径 3-5mm 血斑置于 1.5ml 离心管中, 加入 sdH2O 1ml,振荡离心, 弃上清, 重复步骤两次, 弃上清, 将 5% Chelex-100振荡悬浮后快速用剪掉头的枪头吸取 200μl 加入离心管中, 振荡数...