细胞培养传代冻存复苏操作规程自编

细胞培养程序材料A、仪器1. 净化工作台， 2. 离心机， 3. 恒温水浴箱， 4. 冰箱（ 4℃）5. 倒置相差显微镜， 6. CO2 培养箱， 7. 振荡混合仪8. 酶联免疫检测仪， 9. 移液枪， 10. 电磁力搅拌机， 11. 微孔滤器B、玻璃器皿1. 吸管， 2. 小烧杯（ 100ml），3. 废液缸，C、塑料器皿1. 吸头， 2. 枪头， 3. 96 孔培养板， 4. 15ml 离心管，5. 50ml 离心管， 6. 胶塞，D、其他物品1. 微量加样枪， 2. 红血球计数板，F、试剂1. D-Hanks 液， 2. 小牛血清， 3. RPMI1640，4. 双抗（青霉素、链霉素），5. 0.25% 胰酶， 6.0.025% EDTA 7. 二甲基亚砜（ DMSO），8. MTT溶液：称取 250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml 培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用 0.22um 的微孔滤器除菌，分装， 4℃保存备用，两周内有效。一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养：（一）细胞原代培养1. 贴壁细胞培养法：1）、组织块培养法将所取得的组织用含青霉素、 链霉素 400U/ml 和 400ug/ml 的生理盐水漂洗 2 此，5 分钟/ 次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37° 、5%CO2条件下 30 分钟后将培养瓶正置， 从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小牛血清 15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml ），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37° 培养。待 24 小时候补液。或小块放置后 , 轻轻翻转培养瓶 , 使瓶底朝上 , 然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞, 将瓶倾斜放置在 37℃温箱内。 培养 2~4 小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败， 若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24 小时后再补液，培养 3~5 天时可换液， 一方面补充营养， 一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。其他方法：消化分离法、器官培养略2. 悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化， 可采用低速离心分离， 直接培养， 或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。（二）细胞株 ( 系) 细胞复苏培养细胞复苏的主要操作步骤(1) 佩戴眼镜和手...