质粒DNA的提取及检测实验报告

1/9题目：质粒 DNA 的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习 DNA 琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。二．实验原理1. 质粒(Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从 l-200kb 不等，为双链、闭环的 DNA 分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。2. 载体(Vector):要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、入噬菌体、M13 噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。3.分离质粒 DNA：(1)培养细菌使质粒扩增；(2)收集和碱裂解细菌；(3)分离和纯化质粒 DNA。4. 碱裂解法(1) 溶液 I：50mmol/L 葡萄糖，10mmol/EDTA-Na,25mmol/LTris-HCl(pH8.0)作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止 DNA 的降解(2) 溶液 II：0.4mol/LNaOH，2%SDS，临用前 1：1 配制作用：细胞在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与染色体 DNA 发生变性2/9（3）溶液 III：5mol/L 醋酸钾 60ml，冰醋酸 11.5ml，双蒸水 28.5ml 作用：酸性条件上质粒 DNA 复性，留在上清液。大肠杆菌 DNA 和蛋白质-SDS 复合物等发生沉淀。5. 电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA 的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp 至近 50kb 的 DNA 分子。DNA 的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的 DNA 片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。6. 提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性 DNA、开环 DNA、闭环超螺旋 DNA。当提取的质粒 DNA 电泳时，同一质粒 DNA 泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开环。但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。三．实验材料及设备1.实验材料：（1）含质粒 pUC18 大肠杆菌，1・5ml 塑料离心管，EP 管架，微量取液器和取液器吸头，常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）；（2）提取的 pUC18,琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜,剪刀，取液器吸头。实验设备：2.实验仪器：（1）恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000UL ...