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试验酵母醇脱氢酶的提纯及其性质的研究汇总

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实验三酵母醇脱氢酶的提纯及其性质的研究醇脱氢酶( ADH )是生物体内重要的氧化还原催化剂之一,在生物催化、生物医学领域都有较为广泛的应用。生物体内的很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。醇脱氢酶来源广泛,种类繁多,可按肽链长度分为短链、中链、长链醇脱氢酶,所含肽链氨基酸残基数分别为250、375 和 600~750,酵母醇脱氢酶(YADH )是其中研究和应用最为广泛的一种。酵母醇脱氢酶以NAD+/NADH 为辅酶,可逆催化醇和醛/酮之间的氧化还原反应。酵母醇脱氢酶为四聚体,单个亚基肽链含347 个氨基酸残基,亚基相对分子质量为35 000。(一)酵母醇脱氢酶的提纯一、实验目的1. 学习和掌握醇脱氢酶提纯的原理和方法;2. 掌握醇脱氢酶活力的测定方法。二、实验原理以酵母为原料, 利用热变性、 有机溶剂沉淀蛋白质等方法,提取具有一定纯度的酵母醇脱氢酶。在提纯过程中,每经一步提纯处理,都需测定酶蛋白质含量和活力,并计算得比活力(本实验中比活力=活力单位数 /mg 蛋白质 )。唯有比活力提高了, 才证明所用提纯措施有效,酶制剂的纯度提高了。醇脱氢酶的辅酶NAD (以 NAD 为辅酶的醇脱氢酶,它只作用于一级醇、二级醇和半缩醛脱氢酶, 动物醇脱氢酶还能催化环一级醇脱氢,酵母醇脱氢酶无此活力。另有以 NADP为辅酶的醇脱氢酶,它只作用于一级醇。),它能催化乙醇脱氢变成乙醛,脱下的氢则使NAD +还原。CH3CH2OH+NAD+→ CH3CHO+NADH+H+ 当有过量的醇存在时,NAD+ 被还原的速度与酶活力成正比,酶活力愈高,单位时间产生的 NADH愈多。 NADH对 340nm 紫外线有较强吸收,NAD+ 无此能力,因此可用测定A 340nm 的方法测得反应体系中NADH 含量,从而得知酶活力的大小。0 本实验用 Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量三、实验材料、仪器和试剂1.实验仪器:(1)干酵母粉:将鲜酵母分散成小块,放在搪瓷盘吹干。干燥后,研磨成粉末。(2)烧杯(3)吸管 0.1ml 、0.5ml、 1ml、 2ml、5ml (4)容量瓶(5)试管(6)量筒(7)水浴锅(8)台天平(9)电子天平(10)离心机( 5000r/min )(11)722 型分光光度计(12)UV-900 型紫外可见分光光度计2.实验试剂:(1)3mol/L 乙醇溶液:量取无水乙醇(比重:0.789,相对分子质量: 46.07)174.6ml ,加蒸馏水稀释至1000ml。(2)0.06mol/L 焦磷酸钠溶液(pH8.5):称取焦磷酸钠(Na 4P2O2·10 H2O)22.56g,溶于蒸馏水,稀释至1000ml。(3)0.0015mo...

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