SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术试验报告

实验报告一、实验目的和要求1.了解 SSR 标记的检测方法；2.了解 PAGE银染检测 SSR 的原理；3.掌握 PAGE银染检测 SSR 的技术。二、实验内容和原理1. 根据 DNA 大小及类型的不同，可通过电泳进行分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离 1kb 以下的片段，最高分辨率可达 1bp，适宜于微卫星等位基因间的差别检测。2. 银染方法的建立始于 1979 年对蛋白质的染色，以后逐渐应用于核酸。3. 银染原理：扩增 DNA 经电泳分离后，Ag+可与之形成稳定的复合物，在甲醛的作用下被还原成银颗粒，呈现棕褐色谱带。三、实验仪器与材料1、 实验材料：已准备的 12 个水稻材料的 PCR 产物。2、 实验耗材：PCR 管、枪头（tip）、1 次性塑料手套等；仪器设备：PCR 仪、电泳仪、垂直电泳槽及制胶装置、凝胶成像系统/扫描仪、移液枪、塑料托盘等。3、 试剂及配制：①引物（10mM）：根据含有 SSR 的序列设计而合成的，用无菌双蒸水配制所需浓度。②dNTP 溶液（2mM）：将采购的溶液分装，直接稀释到所需浓度即可。③Taq DNA 聚合酶（5U/μl）：直接采购。④10 x PCR 缓冲液：直接采购。⑤DNA 分子量标准：直接采购。⑥0.5mol/LEDTA ：在 800ml 水中加入 186.1g EDTA-Na.2H2O，搅拌并用氢氧化钠调 PH 至 8.0，定溶至1L，分装后高压灭菌备用。⑦TBE 电泳缓冲液（Tris-硼酸 5×贮存液）：Tris 碱 54g/L 和硼酸 27.5g/L 溶于蒸馏水，加入 20ml (pH8.0)0.5mmol/L EDTA，定溶到 1L。用时稀释 5 倍。⑧上样液（6×）：溴酚兰 0.25%、二甲苯青 0.25%、蔗糖 40%的混合液。⑨封胶液：1g 琼脂糖放于 100ml TBE 煮沸溶解、混匀。⑩30%丙烯酰胺（100 ml）：将丙烯酰胺 29 克和 N、N-亚甲叉双丙烯酰胺 1 克用蒸馏水溶解，定容至 1001ml。或从公司直接采购的 40%（Acr:Bis=29：1）溶液。4、 实验材料说明：①SSR 标记：共 6 个，每组 1 个②模板 12 个：C101、谷梅 2 号、谷梅 4 号、 IR24、 IR64、富锦、CK122、株 6S、 R2106、 316S、 R248、日本晴③PCR：反应总体积为 15μl ，包括 7.5μl 的 2×Taq Master Mix(含 dNTP)，1μl 的模板 DNA(50-100ng)，10μM的上下游引物各 0.5ul，用去离子水补足至 15μl ；94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共 35 个循环；72℃延伸 8min，4℃下保存。④样品：每组领取 12 个 PCR 样品，记录组号和点样位置。四、操作方法...