聚丙烯酰胺凝胶电泳VIP免费

聚丙烯酰胺凝胶电泳1、作用分离蛋白质、核酸2、概念聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、有弹性、透明、化学性质稳定、对pH和温度变化小、没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下合成。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）3、原理（1）丙烯酰胺结构式（2）亚甲双丙烯酰胺PAGE的聚合需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。（1）化学聚合：AP-TEMED系统过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42-。注意：TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合（2）光聚合：核黄素-TEMED系统核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。注意：分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）（根据亚基分子量分离蛋白质）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳概述1967年由Shapiro建立。1969年由Weber和Osborn进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。基本原理1.蛋白质分子的解聚(1)SDS（十二烷基硫酸钠，sodiumdodecylsulfate,SDS)阴离子去污剂变性剂助溶性试剂断裂分子内和分子间的氢键分子去折叠破坏蛋白质分子的二级和三级结构(2)强还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。实验原理--------------------------------------SDS和还原剂的作用：（1）分子被解聚成组成它们的多肽链（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS胶束的特点：（1）形状像一个长椭圆棒（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。2.凝胶浓度的选择由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，因此SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测定蛋白质亚基的分子量。PAGE的浓度与孔径的关系PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。Acr/Bis：20~40完全透明且有弹性；＜10很脆，易碎，不透明；＞100糊状不成形，易破碎。凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。T=（a+b）/m×100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/（a+b）×100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。3、分类按具体操作分垂直板形电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性...