荧光定量PCR实验数据资料VIP专享VIP免费

荧光定量PCR实验数据分析与常见问题解决技术支持黄志2内容•LifeTechnologies公司定量PCR仪产品概览•荧光定量PCR实验数据分析•荧光定量PCR实验常见问题的解决3AB荧光定量PCR仪的发展历史1995世界上第一台定量PCR仪--7700型诞生1997推出面向医疗系统用户的5700型定量PCR仪2000推出7900型384孔定量PCR仪2001推出7900型96孔定量PCR仪2001推出7000型96孔定量PCR仪2004获得定量PCR仪专利－确立AB在业界内的领先地位2004第5代定量PCR仪7300\7500型诞生2007第6代定量PCR仪StepOne和StepOnePlus问世2010第7代定量PCR仪ViiA7发布2011最新荧光定量PCR仪QuantStudio12KFlex发布4AB荧光定量PCR仪家族第一、二代77005700第三、四代70007900第五代73007500第六代stepone/plus第七代ViiA7最新型QuantStudio5荧光定量PCR实验数据分析6荧光PCR实验结果的分析流程查验扩增曲线查验扩增曲线检查/调整基线检查/调整基线检查/调整阈值检查/调整阈值检查NTC检查NTC检查阳性对照检查阳性对照检查阴性对照检查阴性对照分析样品数据分析样品数据7基线与阈值线的设置一般情况下选择软件默认的“自动设置”；特殊情况下或必要时，可以手动设置；手动设置的原则请查询“DataAnalysisontheABIPRISM®7700SequenceDetectionSystem:SettingBaselinesandThresholds:Guide:RevA”，文件号：4370923。8基线的设定系统背景信号，在扣除背景过程中影响扩增信号的数值，最终影响Ct值。默认自动分析，比如设定在“3-15”个循环。手动设置时要避开前期的荧光波动与后期的扩增信号。必要时可以独立设定制定样品的基线取值范围（V2.0）。9阈值线的设定默认设定为同类扩增基线信号标准差的10倍，反映扩增信号具有统计学显著的意义。不同扩增子应当独立设定阈值线。手动设置在“指数扩增期”，避开前期的背景荧光波动与后期的非指数扩增及阴性对照最高点。对于绝对定量实验，阈值线设定在使得标准曲线的决定系数值（R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。对于无标准曲线的实验，阈值线设定在使得重复样品Ct值差异最小的位置。阈值线设定在保障灵敏度均为最佳的位置10实验结果的考评指标定性实验：•是否为显著的“S型”扩增曲线•扩增曲线的“高度”----表示体现扩增性能的“强度”•阳性对照的Ct值是否在“预期”的位置：过早——污染或加样错误过晚——存在抑制剂或扩增体系条件不佳•阴性对照是否报告Ct值污染、探针特异性差、阈值线设定过低绝对定量实验：•标准曲线的斜率或扩增效率•标准曲线的决定系数值：R2•检测样品是否偏离标准曲线•重复样品Ct值的标准差11绝对定量实验效果的评估12CT=klgX0+bCT2—CT1=（klgX02+b）—（klgX01+b）CT2—CT1=k(lgX02—lgX01)CT2—CT1=klg(X02/X01)当扩增效率为100时，K=-3.32，若CT相差1，则两个样品的浓度差异为：10T1T2C-C12XXKlg(X02/X01)=(CT2—CT1)/k5.0XX1032.3112当扩增效率为100时，K=-3.32，两个样品的浓度差异为10倍，则CT差异为：32.310lg32.3C-CT1T212T1T2XXlgC-CkCT值差与模板量差的关系浓度增加1倍，CT值减小1个单位浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位13荧光定量PCR实验常见问题14病原体核酸检测效果的主要影响因素样品采集和储运核酸抽提核酸定量检测采样部位、保存液、冻融导致巨大差别的因素导致一般差别的因素交叉污染、抑制剂、病毒裂解引物、探针设计/合成质量核酸的纯度和完整性预混液的质量样品量样品量、回收率仪器、循环条件15实验污染反应试剂质量问题未正确密封而导致的试剂蒸发错误的荧光染料设置错误的反应程序设置使用错误的耗材荧光污染仪器硬件问题导致异常实验数据的常见原因:16两种容易混淆的阴性对照•无模板的阴性对照在反应体系中不加入核酸模板，而以水为替代的对照目的：监控配制反应体系的试剂是否存在污染。•阴性样品的对照在样品制备过程中，加入已知的阴性样品（或水），并将提取物作为模板加入反应体系，参与整个实验过程。目的：监控整个实验操作过程中是否存在污染。17故障排除时提供有用信息的软件界面18原始荧光组分曲线-v2.019扩增曲线-v2.020标准曲线-v2.021原始多...