测序常见问题及解决策略 一、 PCR 常见问题 1 . 假阴性，不出现扩增条带 PCR 出现假阴性结果，可从以下几个方面来寻找原因： 1 ）模板：①模板中有杂蛋白；②模板中有 Taq 酶抑制剂；③在提取制备模板时丢失过多；④模板核酸变性不彻底。 2 ）酶：酶失活或反应时忘了加酶。 3 ）Mg2+浓度：Mg2+浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 4 ）反应条件：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率。 5 ）靶序列变异：靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR 扩增是不会成功的。 2 . 假阳性 假阳性：出现的 PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。常见原因有： 1 ）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 2 ）靶序列或扩增产物的交叉污染 ：这 种 污染 有两 种 原因：一是整个基 因组 或大 片 段的交叉污染 ，导 致假阳性。这 种 假阳性可用 以下方法 解决：操 作 时应小 心 轻 柔 ，防 止 将 靶序列吸 入 加样 枪 内 或溅 出离 心 管 外 。二 是空 气 中的小 片 段核酸污染 ，这 些 小 片 段比 靶序列短，但 有一定 的同源性。可互相拼接 ，与引物互补后 ，可扩增出PCR 产物，而导 致假阳性的产生，可用 巢式 PCR 方法 来减 轻 或消 除 。 3 . 出现非特异性扩增带 PCR 扩增后 出现的条带与预 计的大 小 不一致，或大 或小 ，或者 同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR 循环次数过多有关。三是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法。 4 . ...
