反转录引物的选择与RealTimePCR引物设计的要求

反转录引物的选择与 Real-Time PCR 引物设计的要求 1）随机六聚体引物： 当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系中所有 RNA分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。 2）Oligo(dT)： 是一种仅对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3'端 Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA 只占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA 可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定 mRNA 的表达水平。 3）特异性引物： 最特异的反转录方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与 mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。 做 Real Time PCR 时，用于 SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求： ① Tm=55-65℃ ② GC=30-80% ③ PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在 80-300bp 之间都可。 ④ 引物的退火温度要高，一般要在 60℃以上。 要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组 DNA 污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组 DNA 污染的影响。 至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS 都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。 五、cDNA 与引物质量检测 取 0.2ml 薄壁 PCR 管，编号。向各管中加入含染料 2× PCR TaqMix10ul；加入正反向引物各 0.5ul（引物浓度 10uM） ，向管中加入混合的 cDNA 各 1ul。各管补加水至 20ul。 组份 加量 2× PCRTaqMix 10ul 10uMPrimer FW 0.5ul 10uMPrimer RV 0.5ul Template DNA 1ul d...