SILAC定量技术方案

精品文档---下载后可任意编辑一 样品制备1. 细胞培育和蛋白提取(1). MEM 培育基的准备(配制 400 mL)① 制备氨基酸储液：分别在 20mL L-Arginine 缺陷型 MEM 培育基中配置(50%正常浓度)的 13C6 L-Arginine hydrochloride 和 13C6, 15N4 L-Arginine hydrochloride 储存液(均称取 26 mg)，待充分溶解后，分别用 μm 的无菌滤器过滤。② 分别加入 20mL 除菌后的氨基酸储液、10%的透析胎牛血清、1%的青链霉素、2mM 的L-Glutamine 和 2mM 的丙酮酸钠并用缺陷型 MEM 培育基定容到 400 mL，贮存于 4°C。每种完全培育基中的氨基酸浓度见表 4-1：表 4-1 MEM 培育基中轻、中、重 L-Arginine 的浓度Cell linesAmino AcidsM. W.Culture MediaAmount(concentration)AL-ArginineRPMI 1640241.9 mg/L ()B13C6 L-Arginine MEM65.0 mg/L ()C13C6, 15N4 L-Arginine MEM65.0mg/L ()(2). 细胞培育 将 A、B、C 三种细胞复苏后，分别接种于 10cm 培育皿中，在常规 RPMI 1640培育基(添加 10%的透析胎牛血清和 1%的青链霉素)中培育 HL-7702，分别使用仅含有 13C6 L-Arginine hydrochloride 和 13C6, 15N4 L-Arginine hydrochloride 的 MEM 培育基培育 B 和 C，经过 5-6 个细胞世代的培育后，将细胞数量扩增到 107-108左右(5-6 盘)。(3). 蛋白提取用 500 μl 全细胞裂解液(50 mM Tris，pH 7.4；150mM NaCl；1%Triton-100；1mM AEBSF；20 μl/μg aprotinin；20μl/μg leupeptin)2. 蛋白质含量测定(1). 采纳改进的 Bradford 法，将 BSA 分别稀释为从范围内若干浓度，待测样品稀释 10 倍、20 倍，各取 20μL 加 80μL HCl，轻轻混匀。(2). 各管再加入过滤的稀释 4 倍的 dye reagent，轻轻混匀，静置 5min 后测 A595 值。(3). 取 A595 值对 BSA 标准浓度作标准曲线，再根据待测样品的 A595 值，从 BSA 标准曲线中确定其浓度。(4). 同位素标记样品与非标记样品根据蛋白含量 1:1 混合。3.SDS-PAGE 分离和染色(1). 电泳条件：4%浓缩胶，12%分离胶;(2). 2×SDS 上样缓冲液的配制：2mL Tris-HCL buffer (, pH 6.8)；2 mL 甘油；1mL 巯基乙醇；4mL10%SDS 溶液；适量水补足体积至 10mL，混匀即得。(3). 电泳条件：4%浓缩胶，12%分离胶，先恒流 10mA，运行时间，再于 20mA 运行至溴酚蓝前沿到达分离胶底部。(4). 胶体考马...