第6章 CpLTP3、CpLTPI.4 基因启动子克隆及瞬时表达分析 为了深入探索蜡梅nsLTPs 基因家族4 个成员CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3 、CpLTP4 在表达和功能上存在差异的原因,需要进一步克隆各个成员的启动子,以便寻找调控方面的差异。我们利用hiTAIL-PCR 法分离得到了CpLTP3、CpLTP4基因的启动子区域,并对调控原件和瞬时表达活性进行了分析,另外两个基因启动子暂时没有得到成功分离,所以没有进行分析。 6.1 实验材料 6.1.1 植物材料 供试蜡梅开花大树品种为罄口蜡梅,种植于西南大学校园内,常规管理。蜡梅小苗通过种子繁殖培育,种子采自西南大学校园罄口蜡梅树。培养条件为湿度85%,16h 光照(2000Lx),温度25℃,8h 黑暗,温度20℃。烟草 W38(Nicotiana tobacu m cv. Wisconsin 38)由本实验室保存扩繁。 6.1.2 菌种和载体 大肠杆菌(Esherichia coli)菌株TOP10,为质粒转化受体菌由本实验室保存。 根癌农杆菌(Agrobacteriu m tu mefacieu s)LBA4404,用于农杆菌介导的烟草遗传转化,由本实验室保存。 克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司。植物表达载体pBI121,具有Km抗性和完整的GUS基因表达元件,用于构建瞬时表达载体。 6.1.3 主要试剂 Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶、Mgcl2 、dNTP、T4 DNA连接酶等购自TaKaRa公司;DL2000、DNA Maker、质粒提取和胶回收试剂盒均购自BioFlux公司;PCR引物合成及DNA测序均由生物工程有限公司合成;氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)和卡拉霉素(Kanamycin,Km)均购自上海生物工程有限公司。 6.1.4 主要设备 紫外分光光度仪(岛津),高速冷冻离心机(HITACHI),台式冷冻离心机(Eppendoff),TGL-16B 型台式离心机(上海安亭),Eppendorf PCR 仪,IKA 型涡旋器(德国产),高压灭菌锅(日本产),超低温冰箱(sanyo),DYYIII 型电泳仪(北京六一厂),超净工作台(苏州净化设备厂), FR-1 型凝胶成像系统(上海复日),722 型分光光度计(重庆川仪九厂),恒温振荡摇床,恒温培养箱,水浴锅。 6.1.5 常用溶液配方 氨苄青霉素(Amp):水溶,超滤,贮存浓度50mg/mL,﹣20℃避光保存。 卡那霉素(Km):水溶,超滤,贮存浓度50mg/mL,﹣20℃避光保存。 TE(pH8.0):10mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0)。 50×TAE(电泳缓冲液),1L:Tris 242g/L,冰醋酸57.1ml, EDTA(0.5mol/L pH 8.0)100ml/L 。 6×琼脂糖凝胶上样缓冲液:溴酚蓝 0.25%...