实验二 聚合酶链反应技术、酶切鉴定 第一节 聚合酶链反应技术 目的： 1．了解PCR 基因扩增技术在DNA 操作中的重要性及应用范围。 2．熟悉PCR 基因扩增的基本原理。 3．掌握PCR 基因扩增技术的具体操作过程。 原理： 聚合酶链反应技术（PCR 技术）实际上是在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA 聚合酶的酶促反应。在反应中混合下列物质：模板DNA 、四种dNTP(包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、引物1、引物2、Taq DNA 聚合酶、缓冲液及Mg2+(MgCl2)，然后经下列过程大量扩增靶DNA，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。 试剂： （1）TaKaRa Taq (5U/ ml) （2）10×PCR 缓冲液(Mg2+ Plus) （3）dNTP 混合液(each 10mM) （4）DNA 模板 (10ng) （5）引物 引物名称 引物序列(5′－3′) 3' 的位置 (nt) 复性温度(℃) 产物长度(bp) 相互覆盖长度(bp) Mit -1F CTC CTC AAA GCA ATA CAC TG 611 58 802 204 Mit -1R TGC TAA ATC CAC CTT CGA CC 1411 Mit -2F CGA TCA ACC TCA CCA CCT CT 1245 58 802 Mit -2R TGG ACA ACC AGC TAT CAC CA 2007 操作步骤： 1. 在一个无菌的0.5mL Eppendorf 离心管内加入 PCR 混合液25 µl 混匀，用100µl矿物油覆盖于反应混合液之上，以防止反应过程水分蒸发。 PCR 反应体系： 反应体系各成分名称 反应体系各成分浓度 各成分体积（µl） PCR 缓冲液 10 × 2.0 dNTP 200 nmol/L 2.0 MgCl2 25 umol/L 1.5 前向引物 10 umol/L 0.2 反向引物 10 umol/L 0.2 Taq 聚合酶 5 U/ul 0.1 模板DNA 50ng/ul 1.0 ddH2O 18.0 合计 25 2．将Eppendorf 离心管放入PCR 仪反应仓中。 3．设置PCR 反应条件为： 94℃94℃72℃72℃5min10s30sTa1min5min4℃+∞30 cycles 4．PCR 产物分析： 采用 1.2％琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物的量、引物扩增的特异性，根据标准 DNA 的量粗略计算 PCR 产物的总量，电泳方法见实验一质粒 DNA 的琼脂糖电泳。 注意事项： 1．用 PCR 扩增目的基因，一般多采用商品试剂盒。若自己配制试剂，配好后必需高压灭菌。 2．用于PCR 扩增的模板DNA 一定要纯，以防止反应体系被痕量非目的基因模板污染。 3．吸加 PCR 试剂时戴上新塑料手套，并在超净工作台上操作...
