慢病毒实验技术实践操作总结 【来源/作者】济宁医学院肿瘤研究中心--李杰 【更新日期】2013-12-30 11:48:37 慢病毒简介 慢病毒载体（Lentivirus Vector ）是以人类免疫缺陷I 型病毒（HIV-1）为基础发展起来的基因治疗载体。能高效的将目的基因或RNAi 片段导入动物或者人的原代培养细胞或细胞系中，即将外源性基因有效的、稳定的整合到宿主染色体上，实现所谓“稳定整合”，从而使目的基因在目标细胞系中持久表达。其区别于一般的逆转录病毒载体的特点是对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。在这里，建议针对如神经元细胞、各种干细胞、心肌细胞等，通常印象中使用传统的转染手段如脂质体2000（Lipofectamine2000）、Qiagen Effecience transfection、或者电转等难以实现目标基因或者RNAi 片段有效整合的细胞，采用慢病毒载体感染的方法，问题将迎刃而解。 目前我们实验室应用的主流转染方法 为什么要用慢病毒实验技术？要解释这个问题，我们有必要来探讨一下现在我们实验室当前主流的转染方法。 1、Invitrogen 公司生产的脂质体2000 在实验中，我们发现脂质体2000 能够高效的将目标片段整合进细胞。并且，脂质体2000与目标质粒的融合效率非常高。但是，其细胞毒性是一个不可忽视的问题。特别是在研究目标基因与抑制肿瘤细胞增殖，或是促进肿瘤细胞凋亡方面。在细胞数量均一化的待处理实验组中，如果脂质体2000 的量控制不好，会导致细胞在转染后大量死亡(大量圆形死细胞会漂浮于细胞板中央)，这对于结果的可靠性和稳定性是硬伤。并且，在脂质体转染的时候，Invitrogen 公司建议采用无血清或低浓度血清的体系下再配合（脂质体2000+目标质粒）的转染。无血清或低浓度血清的培养状态并不是所有细胞都能耐受，会出现一些影响实验进程的意外情况，如细胞形态改变、细胞脱壁。有些细胞在培养过程中有些黑色自由游动的小颗粒，在无血清或低血清培养体系中会以蚕食细胞的方式维系自身的生存。所以，咱们经常听见有同学抱怨说细胞本来好好的，一转染就瞬间爆发这些小黑虫子（杆状细菌）。因此,如若细胞瓶(板)底部出现黑渣子,或细胞表面出现不光滑的现象,最好不要考虑进行脂质体转染实验。而感受态细菌含有的内毒素对细胞同样有毒性，因此质粒提取一定要严格使用去内毒素的质粒抽提试剂盒。推荐 qiagen、Invitrogen 公司中抽质粒试剂盒。转染 microRNA，siRNA时，建议 Invitrogen 公司生产的Lipofectamine® RNAiMAX，转染效率...
