胚胎干细胞体外培养

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的 ICM 及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞 PGCs 后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG 细胞)，也具有 ESCs 的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的 ICM 最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取 ESCs 的时间：以既保证 ESCs 的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定 ESCs 分离获取的最佳时间。以 ICM 为 ESCs 来源时：小鼠取 3～5 天囊胚；猪取 9～10 天囊胚；羊取 7～8 天囊胚；牛取 6～7 天桑葚胚或早期囊胚；人取 7～10 天囊胚。以PGCs 取 ES 细胞时：小鼠取 12.5 天胎儿生殖嵴；大鼠可取 10.5 天尿囊、中胚层组织块、12.5 天背肠系膜或 13.5～14.5 天生殖嵴；牛取 29～35 天胎儿生殖嵴；人取 35～63 天的生殖嵴。 2.分离获取 ESCs 的方法：从 PGCs 分离 ESCs 的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用 EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离 ICM 的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR 小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用 30 分钟，移至 1∶6 稀释的新鲜豚鼠血清中作用 30 分钟，Hank’s 液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存 ICM细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留 ICM 细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精 2.5 天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6 天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而 ICM 细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans 和 Kaufman 采用这种方法第一个建立了小鼠 ESCs 系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后 3～4 天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出 ICM 细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员...