双光子显微镜技术

物宽场显微镜成像焦平焦平标成像BjcfnedcaJCenter,TMMU“重叠像双光子显微镜技术作者：细胞生物组刘洋完整 ppt 请见附件双光子显微镜问世于上世纪 90 年代，是结合了激光共聚焦显微镜和双光子激发技术的产物。目前，双光子显微术以其大穿深、低光毒性、低光漂白等优点而被广泛应用于活体和活细胞/组织的成像观察。本报告将对双光子显微镜发明的背景、实现方式、技术特点、应用领域及发展趋势进行简要介绍。一、双光子显微镜发明的背景光学显微镜的发展历史是一段不断提高分辨率的历史。在传统宽场(Widefieldmicroscope,WF)光学显微镜中，来自标本不同纵深的光线都可以投射到同一焦平面上(视网膜或感光元件在此)，导致被接收的光线 90%是来自焦平面外的杂散光，因此宽场显微镜的成像是整个标本的重叠像，没有纵向分辨能力。对标本内部细节的表现很差，严重影响了分辨率。19S5WijnaendtsVanR 殆汕 dt为了消除杂散光的干扰，MalvinMinsky 于 1957 年提出了一种利用狭小针孔（Pinhole）滤除焦平面外杂散光的设想，并由 G.J.Brakenhoff 于 1978 年借助激光最终实现，这就是激光共聚焦显微镜（Laserscanningconfocalmicroscope,confocal）。BtomedcaJAmRysi 占 CentBF,TMMU与宽场显微镜不同的是，激光共聚焦显微镜在成像侧的焦点位置设置了一个针孔，只允许来自另一个焦点的荧光通过，而来自其他焦平面的杂散光则被屏蔽。通过焦点的荧光被感光元件（光电倍增管、CCD 或 CMOS）接收，形成一个点的荧光强度信号。为了解决二维成像问题，激发光通过一组高速摆动的振镜，在标本上进行 X-Y 方向扫描，来自扫描区域内各点的信号最后通过计算机重新合成为一张图片。1959MalvinMinsky1978G.J,Brakenhoff物标检测针焦平共聚焦显微镜成像xvt-i 描，z 轴进动由于有效滤除了杂散光,激光共聚焦显微镜的分辨率相比宽场显微镜有了本质上的提高（横向 200nm,纵向 400nm），拥有了对样本的特定焦平面进行精细成像的能力（称为光学切片或“细胞 CT”），解决了标本内部细节的问题。在此基础上，激光共聚焦显微镜能够结合多种其它参数，得到重建后的三维图像（XYZ 模式）、动态图（XYt 模式）或光谱图（XY 入）等数据，以供后续的形态学、动力学等定量分析。然而，针孔在滤除杂散光的同时也滤除了大部分焦平面荧光，仅有很弱的荧光到达检测器。若要提高信号强度，势必要加大激发光功率，容易增加对活细胞的光毒性和荧光分子的光漂白。因此，激光...