密度梯度离心法分离 PBMC1。 在 15mL 离心管中加入 5mL 淋巴细胞分离液 Ficoll。2. 取 5mL 抗凝静脉血与 5mL 无菌 PBS 根据 1：1 充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为 1:1:1。3。水平离心 400g×30 分钟。(注意:为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低,即升速为 1，降速为 0，这样调整后,升降速会比较慢，总体离心时间约为 1 小时。)4。 离心后可看见管内分为三层,上层为血浆和 PBS,下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带（如下图），单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外,还含有血小板.5。去除部分上层液体(用移液管吸取，不可倾倒），余下约 1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞.置入另一 15mL 离心管中,加入 5 倍以上体积的PBS,离心 300g×10 分钟，洗涤细胞两次。6。 末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育 2 分钟，裂解红细胞,可根据情况适量增减时间.7.加入 10mL PBS，离心 300g×10 分钟，洗涤细胞两次.8.末次离心后，弃上清，加入含有 10％FBS 的 RPMI1640,重悬细胞,计数，计算细胞活力。用本法分离 PBMC,每 1mL 全血可分离得到 1～2×106PBMC,不同人个体之间存在一定差异.活细胞百分率在 95%以上。注意：1. 所有操作都应在无菌条件下进行。2. 在分离前 Ficoll 和 PBS 等试剂均需在 37℃恒温水浴中预热半小时以上。3. 吸取单个核细胞时不可避开会吸到 Ficoll，而 Ficoll 密度比细胞要大，因此步骤 5 中需加入足量 PBS 稀释，若 PBS 体积太小可能会导致细胞无法离心收集。血浆和 PBS淋巴细胞分离液红细胞和粒细胞单个核细胞
