培训讲义_修改后VIP专享

实验一 植物核酸提取一、植物叶片总 DNA 的大量提取【实验原理】CTAB 法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA 螯合 Mg2+或 Mn2+离子，抑制 DNase 活性；NaCl 提供一个高盐环境，使 DNA 充分溶解在液相中； CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 【实验目的】利用 CTAB 法从植物叶片组织中提取高质量 DNA。【主要试剂】1. CTAB 提 取 缓 冲 液 ： 1.4M NaCl ， 100mM Tris pH 8.0 ， 2% CTAB ， 20mM EDTA，0.5% NaHSO3，2% β-巯基乙醇。室温保存，五年有效。2. 氯仿：室温保存，五年有效。3. 无水乙醇：-20℃保存，五年有效。4. 70%乙醇溶液：将无水乙醇和 H2O 按 7:3 混合。室温保存，五年有效。5. TE 缓冲液（250ml）：2.5ml 1 M Tris-HCl，pH8.0（10mM）；0.5ml 0.5M EDTA，pH8.0（1mM）；加 H2O 至 250ml。室温保存，五年有效。【操作步骤】1. 在液氮中将叶片研磨粉碎，取 1-4 克样品于合适的离心管中（初始样品为 1克，用 13ml 管；初始样品>1 克，用 50ml 管）。2. 每 1 克样品加入 5ml CTAB 提取缓冲液和 25-50ug RNase A （可选） ，颠倒混匀，60-70℃水浴孵育 40-50min，期间混匀 2-3 次。3. 从水浴中取出样品，冷却至室温。可选： 20-25℃ ， 3000g 离心 3min ，转移上清液到新管中。 4. 每 1 克样品加入 5ml 氯仿。颠倒混匀 2-3min。5. 20-25℃，10300g 离心 8-10min，转移上清液到新管中。6. 加入等体积氯仿，重复步骤 4 和 5。可选：步骤 4 和 5 可重复多次，直到获得澄清的上清液。 7. 加入等体积的无水乙醇，轻缓颠倒混匀，直到沉淀出现。8. 沉淀 DNA。方法 1：钩出 DNA。（1） 用接种环钩出 DNA（可选： 1000g 离心 1min ，富集 DNA ） 。（2） 将 DNA（可将多个样品的 DNA 合并成...