细胞复苏传代冻存过程

一、细胞培育（复苏、换液、传代、冻存）（已正）进行细胞培育前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射 20-30 分钟。紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净 5-10 分钟左右后开始操作。1.细胞培育液的配制：配制 50ml 培育液(45ml 基础培育液+5ml 的胎牛血清+500ul 的青霉素/链霉素)（假如基础培育基中自带青/链霉素就无需添加）2.细胞复苏：将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于 37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约 1min。将溶解好的细胞冻存管喷上 75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用 1ml 的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的 15ml 离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培育液2ml，混匀，1000rpm, 3 分钟。然后弃掉上清，加入 1ml 配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在 T25 的培育瓶中加入 4ml 配好的培育基，然后用 1ml 无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25 瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将 T25 取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上 75%的乙醇，放入 37℃ 5%CO2 的孵箱内。（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于 37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。1000rpm, 离心 3 分钟。弃掉上清，然后加入 1ml 配置好的培育基使沉淀的细胞重悬。此时将其转移到 T25 瓶内，再加入 4ml 配好的培育基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将 T25 取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上 75%的乙醇，放入 37℃ 5%CO2 的孵箱内。）3.细胞换液：复苏的细胞在 37℃ 5%CO2 的孵箱内孵育 4-6 个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培育基弃去，然后用高压无菌的 PBS 冲洗 1-2 次，每次 3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的 PBS，小心的用 1ml无菌的大枪头加入 5ml 新奇培育基，喷上 75%的乙醇，放入 37℃ 5%CO2 的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下:将培育瓶内的培育液混匀，用 1ml 无菌的大枪头将培育液小心的转移至 15ml 无菌的离心管中，1000rpm,3 分钟去上清，加入 1ml 配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在 T25 的培育瓶中加入 4ml 配好的培育基，然后用 1ml 无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25 瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将 T25 取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否...