Brd ｕ检测细胞增殖实验实验操作:1． 铺细胞,每个３.5 ｃ m dish 1 ０万个,在 3 ７℃、５％CO2孵箱中培育７ 2h(细胞密度至 50—６ 0%左右)。2． Ｂ rd ｕ(5-溴-2′—脱氧尿苷)加入培育细胞中,１ mg/ml,标记 4 ８ h。(量:Brd ｕ以铺满整个 dish 底面为准。)3． 固定:P ＢＳ洗细胞爬片 3 次,每次 5min,在摇床上晃动清洗,4%PFA 固定 3 ０ min。4． 变性:将固定好得细胞爬片用 PBS 洗 3 次,每次 5min,２ mol/L 得 HC ｌ在 37℃条件下变性５ m ｉ n,可放置于３７℃恒温孵箱,应用封口膜把培育皿封好。(１２ 0 ｒ／m)5． 中与:0、1 ｍ ol/Ｌ得硼酸钠(PH8、3)中与 10min,P Ｂ S 洗 3 次,每次 5min、(50r/m)6． 加入 1ml 得０、2％T ｒ iton Ｘ—100,10 ｍ i ｎ。7． 吸出 TritonX－100,用 PBS 洗３次,每次 5mi ｎ、8． 加入 1ml 3％得 B ＳＡ封闭,室温 1 ｈ,可在摇床上晃动、9． 吸出Ｂ SA,用 PB Ｓ洗 3 次,每次５ min。10.加一抗(尿嘧啶脱氧核苷 B ｒ du(鼠单抗)1:2 ０ 0),用 1%BSA 稀释,4 度过夜。1 １.将孵好一抗得细胞爬片用 P Ｂ S 洗 3 次,每次１ 0min。12。加二抗(羊抗鼠 IgG/Ａ l ｅ xa Fl ｕ or ５ 94 1: 10 ０),用 1％B ＳＡ稀释,避光室温孵育1h。(60 r/ｍ in)13。将孵好二抗得细胞爬片用 PBS 洗 3 次,每次 10mi ｎ、１４.加ＤＡ P Ｉ染细胞核,储存浓度为１ mg／m ｌ,应将 D Ａ P Ｉ完全混匀,可用手弹几下,一般稀释比例为 1:１ 000(用 PB Ｓ稀释),避光室温反应 10min。15。将 DAPI 染好得细胞爬片用 P Ｂ S 洗 3 次,每次 10min。16。中性树胶封片,荧光显微镜观察,200×镜下取 5 个视野,计数 B ｒ du 阳性细胞与蓝染得细胞核数目,然后进行统计分析。试剂配制:a、 B ｒ du 得溶解:室温下,将 250 ｍ g 粉末溶于２、5ml 得 DM Ｓ O 中,储存浓度为 10 ０mg／m ｌ分装,每管 1 ２０ u ｌ,—20℃保存。b。 ２ ｍ ol/L H Ｃ l:取 8.33 ３ mL 12 ｍｏｌ／L Ｈ Cl 得浓 HCl,加入 DDW 定容至 50 mL。c、 ０.1 mol／L 硼酸钠:称量 1.９ 07 ｇ硼砂(Na2B4·1 ０Ｈ 2Ｏ ３ 81、36 g/mol),加入Ｄ DW 定容至５ 0 mL,调ＰＨ=8.3。ｄ、 0、2% Trit ｏ n X—１ 00:有 0、5％得 T ｒ i ｔｏ n—1 ０ 0(2。5 mL 原液溶解于47。５ m...
