(一)实验前应明确得问题 １、 选择适当得细胞接种浓度。一般情况下,96 孔培育板得一内贴壁细胞长满时约有 1 ０ 5个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行 MT Ｔ试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下得生长曲线,确定试验中每孔得接种细胞数与培育时间,以保证培育终止致细胞过满。这样,才能保证 M Ｔ T 结晶形成酌量与细胞数呈得线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。 ２、 药物浓度得设定、一定要多瞧文献,参考别人得结果再定个比较大得范围先初筛、根据自己初筛得结果缩小浓度与时间范围再细筛、切记!否则,可能您用得时间与浓度根本不就是药物得有效浓度与时间。 ３、 时间点得设定。在不同时间点得测定 OD 值,输入ｅ xc ｅｌ表,最后得到不同时间点得抑制率变化情况,画出变化得曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就就是最好得时间点(因为这个时候得细胞增殖抑制表现得最明显)。 4。 培育时间。200ul 得培育液对于 10 得４~5 次方得增殖期细胞来说,很难维持６８ h,假如营养不够得话,细胞会由增殖期渐渐趋向 G ０期而趋于静止,影响结果,我们就是在 48h 换液得、 5。 MTT 法只能测定细胞相对数与相对活力,不能测定细胞绝对数、做 M ＴＴ时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值得升高、 6、 理论未必都就是对得。要根据自己得实际情况调整。 ７. 实验时应设置调零孔,对比孔,加药孔、调零孔加培育基、M Ｔ T、二甲基亚砜、对比孔与加药孔都要加细胞、培育液、Ｍ TT、二甲基亚砜,不同得就是对比孔加溶解药物得介质,而加药组加入不同浓度得药物。 8、 避开血清干扰。用含 15％胎牛血清培育液培育细胞时,高得血清物质会影响试验孔得光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于 10％胎牛血清得培育液进行。在呈色后,尽量吸净培育孔内残余培育液。 (二)实验步骤 贴壁细胞: １。 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入１０ 0ul,铺板使待测细胞调密度至１ 000—1 ０ 000 孔,(边缘孔用无菌 PBS 填充)。 ２、 5%ＣＯ 2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(９ 6 孔平底板),加入浓度梯度得药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。一般 5—7 个梯度,每孔 10 ０ｕ l,设 3—5 个复孔.建议设 5 个,否则难以反应真实情...
