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Dellaporta法小量快速提取植物全基因组DNA

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Dellaporta 法小量快速提取植物全基因组 DNA前言该方法为 QIAGEN 的 DNA 提取试剂盒所采纳,所以获得的 DNA 产量较低但质量相对于 CTAB 及 Quick 法高。推举不喜爱 CTAB 法耗时耗力或无法保证Quick 法结果的同学使用。该方法所得 DNA 可直接用于 T-DNA 的 Genotyping及点突变的 CAPS 或 dCAPS,若要用于 ALM-PCR 克隆未知基因,建议做步骤7(由于实验室现已使用 Tiangen 的 DNA 提取试剂盒,因此该方法不再建议用于克隆)。参考 cold spring harbor protocols: Dellaporta Miniprep for Plant DNA Isolation原文地址: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2025/3/pdb.prot5178.abstract材料与试剂试剂:Tris-HCl、EDTA-Na2、NaCl、SDS、醋酸钾、醋酸钠。1 提取缓冲液名称终浓度Tris-HCl(pH8.0)100mMEDTA-Na250mMNaCl50mMTris-HCl 及 EDTA-Na2通常配成 1M、0.5M 的母液,配置时稀释即可,100mL 配制。2 BTE buffer名称终浓度Tris-HCl(pH8.0)50mMEDTA-Na21mM3 20%(w/v)SDS:20g SDS 加水定容至 100mL4 5M 醋酸钾:49.07g 醋酸钾加水定容至 100mL5 3M 醋酸钠(pH5.2):40.83g NaAc·3H2O 溶解于 80mL ddH2O 中,加冰醋酸至 pH5.2,定容至 100mL方法步骤1 取适当植物植物材料,液氮研磨至粉末状。2 加入 500μl 提取缓冲液,放置于冰上。3 加入 35μl 20% SDS,涡旋振荡混匀,65-70ºC 水浴 10min。4 加入 130μl 5M 醋酸钾,摇动混匀,冰浴 5min。5 20000g 离心 3min,EP 管旋转 180º 后再离心 3min;离心期间,准备新的 EP管并加入 640μl 异丙醇及 60μl 3M 醋酸钠备用。6 离心完成后转移上清至准备好的离心管中,轻摇混匀;20000g 离心 5min,弃上清。7 选作:加入 200μl BTE 缓冲液,重悬 DNA 沉淀;20000g 离心 3min,弃上清。8 加入 700μl 70%乙醇,洗涤两次,室温干燥。9 加水 50 或 100μl 溶解 DNA。附录或说明1 步骤 1 中液氮研磨(枪头捣碎)可换用小杵在提取缓冲液中将叶片研碎,会更省时省力。2 步骤 4 的冰浴时间要求不严格,即便省去亦可(DNA 产量有所减少)。3 步骤 5 中 EP 管旋转 180º 旋转是为了让沉淀聚于管底,方便吸取上清;不旋转亦可但适度延长离心时间。4 各步骤中的离心时间要求并不严格,通常 3min 足够将残渣(步骤 5)或DNA(步骤 6)沉淀。5 步骤 8 中洗涤一次亦可,但须保证晾干残余乙醇(乙醇会影响后续实验中),建议加入 70%乙醇洗涤后放置一小会使 DNA 沉至管底,轻轻倒掉大部分乙醇,通常管底的大约 100μl 不会被倒出,然后离心将管壁上的残液离下,用黄色枪头吸去即可。6 步骤 9 中加水量根据自身情况确定,通常加水 50μl 时使用 1-2μl 做模板进行PCR 或 100μl 时使用 3-4μl。

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