DNA重组与蛋白质分析讲义-354204971

生物化学与分子生物学综合实验讲义（分子部分）简 介HSP16.3 是来自结核杆菌 M.tuberculosis 的小分子量热休克蛋白。HSP16.3 在正常条件下仅有少量表达，当 M.tuberculosis 从对数期到稳定期的转变中显著表达，并成为细胞内的主要蛋白。另外， HSP16.3 还是M.tuberculosis 很强的抗原性蛋白，是 T，B 细胞发生免疫反应的重要靶点。体外实验表明，HSP16.3 具有分子伴侣的活性，HSP16.3 在 39.5℃时可以抑制柠檬酸合成酶的热聚集，且其活性不依赖于 ATP，但不能保护柠檬酸合成酶的活性，说明 HSP16.3 是与部分去折叠的柠檬酸合成酶发生作用，体内蛋白的再折叠可能还需要其它蛋白参加。通过凝胶层析还可分离出 HSP16.3 与柠檬酸合成酶形成的复合物，并在随后的 SDS-PAGE中得到证实。HSP16.3 可能是通过暴露疏水表面来行使其分子伴侣活性的。实验表明：HSP16.3 在较温柔温度和低浓度变性剂诱导下，如极低浓度的盐酸胍（0.05 M），尿素（0.3 M）或 30℃的温度处理时，会暴露疏水表面使得其分子伴侣活力迅速上升。HSP16.3 是 144 个氨基酸组成的，分子量为 16277Da ，其序列分析结果表明它属于-crystalline 相关的小分子量热休克蛋白（sHSP）家族的一员，具有-crystalline 蛋白家族典型的 C 末端保守序列：D/N-G-V-L-T-T/V-X-V/A。小分子量热休克蛋白（small heat shock protein, sHSP）家族的蛋白具有多种不同的生物学功能，但都具有分子伴侣的活性，能与变性的蛋白质底物作用并不依赖于 ATP 参加。这一类蛋白的结构讨论表明它们往往通过形成特定的寡聚结构来发挥功能，如 M.Janneschii HSP16.5 形成二十四聚体，小麦 HSP16.9 形成十二聚体。HSP16.3 是迄今为止发现的几种原核生物的 sHSP 之一，目前，对 sHSP 功能，作用机制了解还很少。实验一 聚合酶链式反应(PCR)扩增及载体质粒提取材料、设备及试剂 一、材料 模板 DNA (已预先稀释; 模版含有卡那霉素抗性位点)上、下游引物混合物（每条已预先稀释为 25μM）上游引物 hspF：5'- CA GGATCC GCCACCACCCTTCCCGTTCA -3'下游引物 hspR：5'- CCG CTCGAG GTTGGTGGACCGGATCTGAA -3'二、设备 移液器及吸头，硅烷化的 PCR 小管，DNA 扩增仪，台式高速离心机。 三、试剂（TaKaRa TaqTM）： 1、10×PCR Buffer (Mg2+ plus) 2、dNTP Mixture (各 2.5 mM)3、TaKaRa Taq 聚合酶 5U/μl操作步骤 一、PCR 反应 （50μl...