(整理)利用短片段同源替换SFHR技术进行位点特异修复CHO细胞中游离的.VIP免费

精品文档精品文档利用短片段同源替换（SFHR）技术进行位点特异性修复CHO细胞中游离的缺陷型EGFP基因生命科学学院00级贺晓路摘要传统的基因治疗主要采用基因扩增（geneaugmentation）的策略，即向细胞中导入正常的靶基因表达序列，补偿细胞中缺陷型靶基因的功能。基因添加策略在遗传疾病的治疗中存在着严重的缺陷，从而限制了其临床应用。近年来发展起来的位点特异性基因修复（Site-specificGeneCorrection）技术，如短片段同源替换技术（SmallDNAFragmentHomologousReplacement，SFHR），克服了基因添加策略的缺点。位点特异性的基因修复技术源于对同源重组（HomologousRecombination）的研究，即通过导入与正常靶基因同源的DNA短片段，通过细胞中的DNA修复或者同源重组的机制，特异性地修复缺陷型靶基因中的突变。利用位点特异性的基因修复技术不仅可以修复靶基因中存在的突变，而且能够在基因组中引入突变，因而在基因治疗和基因功能研究方面具有巨大的应用前景。目前，国际上关于短片段同源替换技术的研究处于实验阶段。本文中，我们利用短片段同源替换技术在中国仓鼠卵巢（ChineseHamsterOvary，CHO）细胞中对特异性修复染色体外游离基因的可能性进行了探索性的研究。我们利用绿色荧光蛋白报告基因作为检测系统，可以在荧光显微镜下灵敏地观察到经特异性修复后具有绿色荧光的细胞，并可以进一步通过FACS（FluorescenceActivatedCellSorter）定量检测基因转变的效率。实验结果表明：在利用最适浓度的阳离子脂质体Lipofectamine?2000（LF2000）转染的条件下，我们将载体上绿色荧光蛋白基因（EnhancedGreenfluorescentProteingene,EGFP）的第58位色氨酸密码子(TGG)突变为终止密码子（TAG），能成功地终止绿色荧光蛋白的表达。分别将带有第58位色氨酸密码子(TGG)的DNA片段FG1（393bp）和FG2（695bp）与上述含有缺陷型EGFP基因的载体用最适浓度的LF2000共转染CHO细胞后，用荧光显微镜皆能灵敏地检测到回复绿色荧光的细胞。进一步用FACS分析，确定了FG1和FG2介导基因转变的细胞的比例，证实了FG1和FG2分别修复了载体中缺陷型的绿色荧光蛋白基因EGFP。关键词短片段同源替换，位点特异性基因修复，同源重组，基因打靶精品文档精品文档1.引言传统的基因治疗其实是一种基因扩增（GeneAugmentation）机制，即通过载体系统将正常基因导入，使正常蛋白在转染的细胞里表达，从而达到治疗的目的。这种方法的缺点是【1，2】：（1）为了使转入的正常基因长期有效表达，需要将外源的基因整合进入宿主细胞基因组，但是传统的方法可能导致发生较高频率的非同源重组，随机插入的DNA片段可能引起细胞基因组的功能紊乱；（2）如果采用非病毒载体，载体的大小限制了那些保证转基因适量表达的重要调节因子的载入，cDNA的大小受限制，构建载体比较困难，而且转化较大的载体不容易进入细胞内；（3）若采用病毒载体，转基因所引入的病毒成分可能引起免疫反应，从而造成转基因失败；（4）这种传统的基因治疗方法只能用于治疗隐形突变所造成的基因病；（5）成功率比较低，等等。这些限制使得人们寻找新的方法，而最新的方法是用基因打靶（GeneTargeting）的方法对突变位点进行直接的基因修复（GeneCorrection）。短片段同源替换(SmallFragmentHomologousReplacement，SFHR)是一种改进的基因打靶策略【9】，它源于同源重组，是将与靶基因序列同源的400-800nt的单链DNA（single-strandDNA,ssDNA）或者双链DNA(double-strandDNA,dsDNA)导入细胞，该DNA片段中含有特定的错配碱基、一个或几个碱基的缺失或者插入，用来更正基因组序列中的原一个或者多个核苷酸突变【3--5】。如下图所示：图1、SFHR技术修复基因可能的机理而SFHR作为一种利用基因打靶进行基因治疗的策略，它具有一系列优于上述1.以靶基序列为模板、对其两端分别设计上游引物（forwardprimer,FP）和下游引物(reverseprimer,RP)，通过PCR扩增得到400-800bp的同源dsDNA短片段；然后通过热变性得到相应的ssDNA，转染入细胞。2.ssDNA进入细胞核，同细胞基因组作用，形成D-loop结构，并且与之发生重组和交换；3.内源性的基因修复使得基因组DNA序列更正为与s...