第20讲基因工程和克隆技术考点考试内容考试要求基因工程1.工具酶的发现和基因工程的诞生a2.基因工程的原理和技术b3.基因工程的应用a4.活动：提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案c植物克隆植物的克隆b动物克隆动物的克隆a基因工程1．基因工程的操作工具(1)与DNA有关的四种酶项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键形成产物粘性末端或平末端形成重组DNA分子新的DNA分子形成单链DNA(2)限制酶①识别序列的特点：呈现碱基互补对称。无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；=====以=====为轴，两侧碱基互补对称。②切割后末端的种类③限制酶的选择技巧a．根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类Ⅰ.应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。Ⅱ.不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。Ⅲ.为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。b．根据质粒的特点确定限制酶的种类Ⅰ.所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的粘性末端。Ⅱ.质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。(3)限制酶和DNA连接酶的关系①限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。③DNA连接酶起作用时，不需要模板。(4)载体①条件与目的条件目的稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择②作用a．作为运载工具，将目的基因导入宿主细胞内。b．利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。2．基因工程的基本操作程序和应用(1)获取目的基因的3种途径①从基因文库中获取。②PCR技术扩增。③化学方法人工合成。(2)基因表达载体的组成目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。(3)目的基因导入受体细胞的方法①导入植物细胞a．农杆菌转化法；b.基因枪法；c.花粉管通道法。②导入动物细胞：显微注射法。③导入微生物细胞：Ca2＋处理法(感受态细胞法)。(4)目的基因的检测与鉴定的方法①检测目的基因是否导入受体细胞：DNA分子杂交法。②检测目的基因是否转录出mRNA：分子杂交技术。③检测目的基因是否翻译出蛋白质：抗原—抗体杂交技术。④个体生物学水平鉴定：根据表达性状判断。3．基因工程的常考点(1)目的基因插入位置：启动子与终止子之间。(2)将目的基因导入受体细胞没有碱基互补配对现象。(3)常用的受体细胞①植物：受精卵、体细胞。②动物：受精卵。③微生物：大肠杆菌、酵母菌等。(4)原核生物作为受体细胞的优点：多为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少。某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_____________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是___________________________________；并且_________...
