荧光原位杂交FISH实验步骤与方法（精选文档）（文档可以直接使用，也可根据实际需要修改使用，可编辑欢迎下载）FISH实验步骤一、实验仪器：荧光显微镜:高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160C以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒定温度恒温水浴锅照相机(与荧光显微镜配套)：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、0.2mol/L(pH7.4磷酸缓冲溶液(PB试剂为NaH2P042H20和Na2HP0412H2O。-----0.2M的NaH2P04溶液：31.2gNaH2P042H20,加蒸馏水1000mL溶解-----0.2M的Na2HP04溶液:71.632gNa2HP0412H2O加蒸馏水至1000ml溶解----0.2M(pH7.4磷酸缓冲溶液(PB:19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合高压灭菌，常温保存。2、0.03mol/L磷酸盐缓冲溶液((PBS)试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB——0.03MPBS溶液：22.8gNaCI,150ml磷酸缓冲溶液(PB，加蒸馏水至1000ml，混匀——0.02MPBS溶液：取100ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml——0.01MPBS溶液：取50ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至150ml高压灭菌，常温保存3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通风橱内进行操作）-----将略小于2/3体积的水（660ml）加热到50C,------40g多聚甲醛PFA，边搅拌边加入到水中，继续保持60C——1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。——1/3体积的PBS溶液，——用Hcl将pH调至7.2，定容，----用孔径为0.22卩谥勺滤膜过滤，—4C保存最多保存两天，或者取少量保存在-20Co（加热时温度不宜过高，为60C-65C，否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差）。4、1mol/L（pH8.0Tris-HCI缓冲液的配置---121.1gTris（三羟基氨基甲烷,加800mL蒸馏水溶解，加入大约42mL的浓HCI---用1M的HCI或IM的NaOH将pH调至8.0,最后加蒸馏水至1000MI高压灭菌，4C冰箱保存。5、10%SDS---10gSDS（十二烷基硫酸钠）于50ml灭菌水中，加水至100ml，分装后室温保存。灭菌，或用滤膜过滤称取SDS时需戴口罩！&0.5MEDTA（pH8.0）溶液的配置----186.1g乙二胺四乙酸二钠加800mL蒸馏水溶解，剧烈搅拌（最好使用磁力搅拌机-----用NaOH调节溶液的pH至8.0,然后定容至1000mL。7、杂交缓冲液配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中，各试剂的加入顺序:360卩L5MNaCl40卩LIMTris—Clx卩L10%甲酰胺（见下表）y卩L无菌水（见下表）2卩L10%SDS0.22yn孔径的滤膜过滤，4C保存。表1配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水的体积甲酰胺浓度（%）甲酰胺体积x0051001020015300204002550030600357004080045900yL）无菌水体积159814981398129811981098998898798698y（y（501000110059849855甲酰胺有剧毒，操作时需戴手套，在通风处内进行，废液需要回收）不同甲酰胺杂交液的配制甲酰胺浓度5MNaCI溶液1MTris-HCI（%）(mL)(mL728207283572840557288、杂交后洗涤液的配置配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中，各试剂加入的顺序如下：ZuLMNaCI1mL1MTris-HCl（pH7.610%SDS甲酰胺体无菌水体积y积x(mL（mL）（mL）0.480239.60.4140179.60.4160159.60.422099.6无菌水加至50mL50卩L1%SDS500卩LEDTA表2根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而定的探针清洗液液中NaCl体积数甲酰胺浓度%0510152025303540455055NaCI体积z(D9000640046003280225015901120800560400280200NaCI最终浓度(mM)9006404603282251591128056402820不同甲酰胺对应的洗涤液的配制甲酰胺浓度（%）5MNaCl溶1MTris-HCl(mL10%SDS(mL0.5MEDTA液（mL）（mL）无菌水体积（mL）2083584085580.40.40.4441.638646.44.48381.2383.120.4418369.69、4',6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid(DAPI常备：1mg（1-1需要稀释为：1111灭菌储存在-20C（用铝箔覆盖管子DAPI可诱变致癌，所以在使用时要戴手套并且收集废液，包括早使用移液管时。为了避免使用时对溶液造成污染，所有的溶液应取出置于50ml管中，够每天使用的量。三、实验步骤：1、玻片的预处理：（1）玻片预处理1）玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干净，在实验室可用超声清洗代替刷洗（次10min），然后用清水浸泡过夜；2）硅化处理：4~5次每第二天换用1%的盐酸浸泡24小时，然后用蒸馏水清洗干净后放入高压灭菌锅灭菌，60°C烘干。盖玻片用锡纸包好...
