质粒的提取纯化及验证VIP免费

一细菌的收获和裂解1.收获1）将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。2.碱裂解法1）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。3）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L.盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3－5分钟。4）用微量离心机于4℃12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。5）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA.6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA.振荡混合，于室温放置2分钟。7）用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟。8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。9）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。i.此法制备的高拷贝数质粒（如Xf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3－5μg.ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μlDNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温育1－2小时。将剩余的DNA贮存于－20℃。iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：二、质粒DNA的纯化聚乙二醇沉淀法质粒DNA1）将核酸溶液所得]转入15mlCorex管中，再加3ml用冰预冷的5mol/LLiCl溶液，充分混匀，用合适转头于4℃下以10000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA.2）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10000转/分离心10分钏，回收沉淀的核酸。3）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。4）用500μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。5）加500μl含13％（w/v）聚乙二醇（PEG8000）的1.6mol/LNaCl，充分混合，用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟，以回收质粒DNA.6）吸出上清，用400μlTE（pH8.0）溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。7）将水相转到另一微量离心管中，加100μl10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA.8）吸去上清，加200μl处于4℃以12000g离心2分钟。9）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10）用500μlTE（pH8.0）溶解沉淀1：100稀释[用TE（pH8.0）]后测量OD260，计算质粒DNA的浓度（1OD260＝50μg质粒DNA/ml），然后将DNA贮于－20℃。