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一细菌的收获和裂解1.收获1)将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml并通气良好(不盖紧)的试管中,然后接入一单菌落,于30℃剧烈振摇下培养过夜。2)将1.5ml培养物倒入微量离心管中,用微量离心机于4℃以12000g离心30秒,将剩余的培养物贮存于4℃。3)吸去培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,轻缓抽吸,并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽可能使吸头远离细菌沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。2.碱裂解法1)将细菌沉淀,所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中,剧烈振荡。溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液I可成批配制,每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散,将两个微量离心管的管底部互相接触震荡,可使沉淀迅速分散。2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)1%SDS盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡,将离心管放置于冰上。3)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L.盖紧管口,将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3-5分钟。4)用微量离心机于4℃12000g离心5分种,将上清转移到另一离心管中。5)可做可不做:加等量酚:氯念,振荡混匀,用微量离心机于4℃以12000g离心2分钟,将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚:氯仿进行抽提,然而由于一些未知的原因,省略这一步,往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA.6)用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA.振荡混合,于室温放置2分钟。7)用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟。8)小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽量使吸头远离核酸沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。9)用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀,按步骤8)所术方法去掉上清,在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。i.此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC),其产量一般约为:每毫升原细菌培养物3-5μg.ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA,可取1μlDNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内,加1μl10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶,在适宜温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物:二、质粒DNA的纯化聚乙二醇沉淀法质粒DNA1)将核酸溶液所得]转入15mlCorex管中,再加3ml用冰预冷的5mol/LLiCl溶液,充分混匀,用合适转头于4℃下以10000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA.2)将上清转移到另一30mlCorex管内,加等量的异丙醇,充分混匀,用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10000转/分离心10分钏,回收沉淀的核酸。3)小心去掉上清,敞开管口,将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴,敞开管口并将管侄置,在纸巾上放置几分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。4)用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中,于室温放置30分钟。5)加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG8000)的1.6mol/LNaCl,充分混合,用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟,以回收质粒DNA.6)吸出上清,用400μlTE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。7)将水相转到另一微量离心管中,加100μl10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于4℃以12000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA.8)吸去上清,加200μl处于4℃以12000g离心2分钟。9)吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10)用500μlTE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀释[用TE(pH8.0)]后测量OD260,计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml),然后将DNA贮于-20℃。

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