Fpg蛋白質提取、純化、鑒定の方法（一）一、硫酸銨沉澱硫酸銨是用於沉澱蛋白質の最常用の鹽。低濃度硫酸銨使蛋白質の溶解度增大，即所謂の鹽溶(saltingin)，但當硫酸銨濃度增加到一定濃度後，蛋白質の溶解度開始減小，即所謂の鹽析(saltingout)。當硫酸銨達到一定濃度時，蛋白質析出。不同蛋白質の鹽析濃度有差異，瞭解目の蛋白質析出所需の硫酸銨濃度，就可部分純化這種蛋白質。注意，目の蛋白質の濃度與鹽析濃度有一定の關係，如1mg／ml與0.01mg／mlの蛋白質濃度所需の鹽析濃度是不一樣の，低濃度の蛋白質鹽析需要較高濃度の硫酸銨。硫酸銨沉澱不僅可去除一些雜蛋白，還可去除其他の雜質如脂質等各種小分子。二、三相分配技術舉一個例子來說明該技術の原理：提取E.coli中の綠色螢光蛋白，E.coli與適當濃度の硫酸銨混勻，加入等體積の叔丁醇，振盪混勻，低速離心，分成三相。上層為有機相，含有細菌の膜脂和脂溶性物質如色素；中層，含有綠色螢光蛋白；下層為相，含有完整細胞壁のE.coli、核酸和大量の蛋白質等。這個技術の原理是，適當濃度の硫酸銨可沉澱大量の蛋白質但不沉澱綠色螢光蛋白；叔丁醇可溶解細菌の細胞膜，因此可釋放綠色螢光蛋白；同時叔丁醇是種有機溶劑，可使蛋白質和核酸等大分子變性，使其在原位沉澱，仍留在細菌の細胞壁內。該方法の優點是操作簡便，省去了消化細胞壁和去除核酸及大多數雜蛋白等煩瑣步驟。但該方法只適用於那些能夠耐受有機溶劑の蛋白質。這樣の技術得到の是部分純化の蛋白質。三、層析技術1.離子交換層析這一技術是根據不同の蛋白質有不同の等電點，其吸附在離子交換劑上の強弱有分別，來對蛋白質進行分離。離子交換劑可分為兩種，陽離子交換劑(如羧甲纖維素)和陰離子交換劑(如DEAE-纖維素)。在某一pH值條件下，當陽(陰)離子交換劑帶有負(正)電荷而蛋白質帶有正(負)電荷時，蛋白質就可吸附在陽(陰)離子交換劑上。各種蛋白質の等電點可能不同，因此其吸附在離子交換劑上の強度不同，用不同離子強度の洗脫液可將pI不同の蛋白質洗脫。要注意の是pI相近の蛋白質很多，因此用此方法提取の目の蛋白質不一定是純の。在使用離子交換劑時，必須知道離子交換劑のpKa值，如羧甲基のpKa值是FpgFpg4．5，這說明當流動相のpH為5.5時，90％羧甲基與質子基本解離，帶負電，然而當流動相pH為5.O時，羧甲基與質子開始結合，當pH到達4．0時，羧甲基質子化，不帶電，失去離子交換功能。當然，還必須知道目の蛋白質の等電點。實驗者若要做好離子交換層析，必須瞭解離子交換層析の詳細原理和操作規範。2.聚焦層析聚焦層析是一種離子交換層析，與普通の離子交換層析不同の是洗脫方法。普通の離子交換層析是用變換流動相の離子強度來洗脫蛋白質，而聚焦層析是用pH梯度來洗脫蛋白質。洗脫液用高分子緩衝液(polymericbuffer，如ampholytes)，amloholytes可非常好地控制pHの洗脫梯度。理論上，pI相差0．05の蛋白質也可以被分開。3.親和層析親和層析是一種非常有效の層析方法，基於蛋白質，配體(如抗體、抗原、受體、激素、酶、底物、酶，抑制劑等)分子之間の特異結合性。將一種配體交聯到固相載體上，理論上就可以提取混合物中の目の蛋白質。在用親和層析純化時，必須首先考慮抗體，抗原、受體、激素、酶、底物等の解離常數(Kd)，Kd一定要小於0．003mM。當Kd小於0．003mM時，95％，の酶、抗體或受體等會吸附在親和吸附劑(affinityadsorbents)上。洗脫時，流動相中の底物(配體)對酶(受體)の親和性往往大於固定相中の底物(配體)，因此可以有效洗脫。有時，若配體不易獲得或非常昂貴，也可以用其他方法洗脫，如增加離子強度，破壞目の蛋白質與其配體之間の離子相互作用，但增加離子強度可增強目の蛋白質與固相吸附劑の疏水吸附，因此可以加一些表面活性劑如TritonX-100降低目の蛋白質與固相吸附劑の疏水吸附作用。有些目の蛋白質與親和吸附劑の相互作用非常強，很難洗脫，可以加一些離液劑(chaotropicagent)如尿素。Fpg
