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细胞试验细胞骨架组分的荧光染色观察VIP免费

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细胞生物学实验细胞骨架组分的荧光染色观察一、实验目的1、掌握细胞骨架的显示方法2、掌握荧光显微镜的使用方法3、了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构4、了解荧光探针Hoechst33342(Ho.33324)与细胞成分的结合特性和光谱特性二、实验原理1、微丝股价是一种高度动态的三维网状结构,与细胞的多种生理活动如细胞运动、胞质分离、细胞器的定位、细胞内物质的运输、吞噬作用、细胞极性生长等密切相关。2、鬼笔环肽(phalloidin)是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱,它同细胞松弛素的作用相反,只与聚合的微丝结合,而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后,抑制了微丝的解体,因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。3、由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白,因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响.此外,较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用.因此,用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法。三、实验材料1、材料:CHO(中国仓鼠卵巢细胞)2、试剂:(1)PEM:50mMpipes(pH6.9),5mMEGTA,5mMMgSO4,0.225M山梨醇(2)0.5%TritonX-100溶于PEM缓冲液中。(3)4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。四、实验步骤1、取出上次实验爬片于小盖玻片上的CHO细胞;2、取出培养有CHO细胞的盖片,于小平皿中37℃预温PEM洗3次(每次1mL);3、37℃预温4%多聚甲醛固定细胞15min(1mL)4、37℃预温PEM洗3次5、加入0.5%TritonX-100处理约10min(1mL);6、取一洁净的载玻片,按照其的大小在其上放置一条封口膜,在封口膜上滴加20μL60nMAlex-phalloidin10L湿盒中室温染色30min;7、在parafilm膜上加PEM,待盖玻片被冲起后,再轻轻揭下盖玻片;8、37℃预温PEM洗数3次;9、滴加10LHo.33342复染色;10、荧光镜下观察。【注意事项】1、注意不要弄碎盖片,分清细胞所在面;2、各步洗细胞要轻,勿使细胞脱落;3、荧光观察注意避光操作4、节约试剂。五、实验结果图一:CHO细胞微丝荧光染色图图二:CHO细胞细胞核荧光染色图图三:CHO细胞微丝与细胞核荧光染色叠加图六、实验结果分析染色后微丝呈绿色,细胞核为蓝色,染色较为清晰。但细胞数量较多,导致有些染色结果重叠。七、思考题1、PEM缓冲液的作用是什么?细胞内的微丝在含有ATP和Ca2+及低浓度的Na+,K+等阳离子溶液中,趋于解聚成G-actin;而在Mg2+和高浓度的Na+,K+等阳离子溶液中,G-actin则装配为F-actin。PEM缓冲液提供高Mg环境,让单体肌动蛋白(G-actin)聚合成丝状肌动蛋白(F-actin)。同时,EGTA能螯合Ca2+,使G-actin装配成F-actin,微丝骨架保持聚合状态且较为舒张。用PEM缓冲液处理细胞,能够模拟体内环境并提高细胞骨架的稳定性。2、0.5%TritonX-100处理细胞的作用是什么?0.5%TritonX-100处理细胞的作用是溶解细胞膜上的脂类和蛋白质,增加细胞膜的通透性,使荧光染料能够更容易地透过细胞膜与F-actin特异性结合。3、鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么?(1)鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优点:鬼笔环肽的分子量小,很容易通过细胞,不需要对细胞进行冷丙酮和TRITONX-100处理。鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合,通过让这种毒素吸附于荧光染料上面,可以研究细胞的内部工作机制,窥视细胞如何分裂。(2)鬼笔环肽用于细胞骨架研究的缺点:对细胞有毒性,价格昂贵。参考文献:细胞生物学实验(桑建利,谭信)

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