质粒抽提原理和详细操作步骤VIP免费

专业资料质抽提实验室必备技能之一聲质存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状分子。质抽提从细菌中分离质冇方法包括个基本步骤：培养细菌使质扩增；收集和解细菌；分离和纯化质。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（）和（一般^少使用）可使细胞膜解。经溶菌酶和或处后，细菌染色体会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体比质大得多，受机械和核酸酶等的作用而被断成同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处时，细菌的线性染色体丈性，而共价闭合环状，简称）冇两条等会相互分开。当外界条件恢复正常时线状染色体结段难以复性而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质双链又恢复原状，重新形成天然的超旋分子，并以溶解状态存在于液相中。质抽提最常用的方法是碱解法，它具有得高、适用面广、快速和纯高等特点。当然，碱解法也有缺陷：容导致可逆的变性。要低可逆的变性，就要控制好碱解的时间。碱解法抽提质需要用到以下三种溶液溶液I葡萄，压下蒸汽灭菌54°C保存。溶液n（从忙存液中现用现稀释），（室温簾存）。溶液皿5l乙酸钾00，冰乙酸5，无菌水25，4°C保存，使用时置于冰浴中。专业资料下面介绍-下碱裂解法小提质粒的具体操作：0柱平衡:向吸附柱中加入500“1平衡，2000离心300，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜提高质粒的得率吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。02收菌：将过夜培养的菌液用000，23低温离心，吸弃液体培养基；注意：高拷贝的质粒，需要55的培养菌液；低拷贝的质粒，则需要530的培养菌液；残留的液体培养基过多会影响细菌的裂解效果，应尽可能吸干培养基。03向离心管中加入250“1溶液I（加入），吹匀菌沉淀并将悬液转移至新5管中；注意：菌体悬浮不完全会导致裂解不完全，质粒提取量和纯度会降低。04向管中加入250“1溶液I［（裂解），温和翻转管次0，使菌体充分裂解，液体变得澄清浓稠（开盖拉丝）；注意：所用时间不宜超过5，以免质粒被破坏；切勿剧烈震荡；液体夫变得澄清，则表明裂解不充分，可适当减少菌体量或增大使用量；若溶液I出现浑浊，可37C水浴几分钟,待液体恢复澄清即可使用。05向管中加入350“1溶液皿，温和翻转管次0，此时可观察到管内出现白色絮状沉淀，2000室温离心0；注意：若上清中仍有少量白色絮状物，可再次离心直至液体澄清。06将离心后上清转移至吸附柱中，000r离心060，s倒掉收集管中的废液；专业资料0可选：向吸附柱中加入500“lBufferPD（富含蛋白酶），000r离心，倒掉收集管中的废液；注意：此步对富含内源核酸酶的宿主菌（e）贮必须的，对于e宿主菌可省略。0向吸附柱中加入600“lWashBuffer（加入无水乙醇），000r离心，倒］掉收集管中的废液；0重复步骤一次；0将吸附柱和收集管放回离心机中，000r空转离心；注意：此步骤非常关键，乙醇是否去除干净会影响后续的洗脱效率以及P等效果。将吸附柱转移至新的5管*P，拿到超净工作台中开盖鼓风吹50；向吸附柱膜的中央滴加050“1预热luBuffer或者DD水关盖静置5，000r离心；注意：洗脱Buffer预热后效果更好；可以根据质粒的拷贝数、宿主菌等因素调整洗脱Buffer的添加量。离心后将P管内的液体重新滴加至吸附柱膜上，000r离心做好标记，取2“1质粒跑琼脂糖凝胶电泳检测验正；提取出的质粒2°C保存。专业资料抽提质粒中的常见问题提不出质粒或者质粒提取量很少菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如柯斯质粒在大肠杆菌中保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。2质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。菌种老化:若是甘油保藏菌，需要在活化后再培养摇菌；建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。叹附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如T或者2xYT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是...