大肠杆菌DH5a感受态的制备,质粒验证VIP免费

大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备，质粒的转化及提取一实验目的1，了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作技术。2，了解和掌握质粒转化的原理和操作步骤。3，掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法，以及提取过程中各试剂的作用。二实验原理1，大肠杆菌感受态细胞制备的原理感受态是细菌细胞具有的能接受外源DNA的一种特殊生理状态，将正在生长的大肠杆菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，此时的细胞呈现出感受态。2，质粒转化原理在0℃下外源DNA可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激可诱导细胞吸收DNA。转化了质粒DNA的大肠杆菌经培养可以使质粒编码的抗生素抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的大肠杆菌细胞可以在含有相应抗生素的培养基上涂布生长，而没有转化的细胞则无法生长。3，质粒提取原理质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后,溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。三仪器，材料及试剂仪器：恒温培养箱，离心机，恒温摇床，超净工作台，高压灭菌锅，电泳仪，水浴锅等材料：大肠杆菌DH5α菌株，大肠杆菌BL21菌株，pCMV质粒试剂：SolutionI，SolutionII，SolutionIII，1mol/LCaCl2，TE缓冲液，70%乙醇，酚：氯仿（1:1）等。四实验步骤1，试剂的准备SolutionI:1，量取下列溶液，置于1L烧杯中。1MTris-HCL(pH8.0)25mL0.5MEDTA(pH8.0)20mL20％Glucose（1.11M）45mLdH2O910ml2，高温高压灭菌后，4℃保存。SolutionII：1，量取下列溶液，置于500mL烧杯中。10％SDS50mL2NNaOH50mL2，加灭菌水定容至500mL，充分混匀。SolutionIII：1，量取下列溶液，置于500mL烧杯中。KOAc147gCH3COOH57.5g2，加入300ml去离子水后搅拌溶解。3，加去离子水将溶液定容至500。4，高温高压灭菌后，4℃保存。LB培养基：1，称取下列试剂，置于1L烧杯中。Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g2，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。3，滴加5NNaOH（约0.2ml），调节pH值至7.0。4，加去离子水将培养基定容至1L。5，高温高压灭菌后，4℃保存。10×TEBuffer：1，量取下列溶液，置于1L烧杯中。1MTris-HClBuffer（pH8.0）100ml500mMEDTA（pH8.0）20ml2，向烧杯中加入约800ml去离子水，均匀混合。3，将溶液定容至1L后，高温高压灭菌。4，室温保存。2感受态细胞制备1）从-80℃冰柜中取出一支冻存的大肠杆菌DH5α菌株，在冰块上解冻后，于事先照过紫外的超净台中，用无菌接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上分区划线，将菌种迅速放回-80℃保存。平板做好标记后，于37℃培养约16小时,该细菌菌落在LB培养基上为1-2mm的透明的淡黄色菌落，有特殊的臭味。2)在照过紫外的超净台中，用灭菌的牙签挑取单个菌落，接种入装有1mlLB培养液的1.5mlEP管中，封口膜封好，于37℃恒温摇床培养10-12小时，直至对数生长期。3）将该时期的细菌悬液转接于100mlLB液体培养液中，37℃，220rpm，震荡扩大培养约3h，测细菌OD600，以0.3-0.4之间最佳。4）将扩大培养后的培养物在冰上冷却10min，转入50ml离心管，4℃,4000rmp离心10min。5）倒净上清液，流尽残余液体，加入10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液（使细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面）轻轻悬浮细胞，冰浴30min。6）4℃,4000rmp离心10min。7）弃去上清，加入2ml预冷的15％甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液再次悬浮细胞，即制成了感受态细胞悬液。8）每个1.5mlEP管分装200μl的感受态细胞，-70℃保存。3转化1）将感受态细胞从-70℃拿出，放冰块上解冻。2）在超净工作台中，...