Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用VIP免费

遗传HEREDITAS(Beijing)25(5):628～632,2003专论与综述收稿日期:2002-07-19;修回日期:2002-12-23基金项目:国家高技术发展计划(2001AA215211)和首都二四八创新工程(H010210360119)资助[NationalHigh2technologyDevelopmentProject(2001AA215211)andCapital“248”KeyInnovationProject(H010210360119)]作者简介:胡(1975-),男,硕士研究生,专业:动物学。Tel:010-66948835,E2mail:matthukun@sina.com通讯作者:黄留玉(1962-),男,研究员。Tel:010-66948805,E2mail:huangLY@nic.bmi.ac.cnRed重组系统及在微生物基因敲除中的应用胡1,2,史兆兴1,赛道建2,黄留玉1(1.军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;2.山东师范大学生命科学学院,济南250014)摘要:在完成了对各种微生物基因组的测序以后,功能基因学的研究变得尤为重要。研究基因功能最直接的方法便是将待研究的基因失活。最初构建基因突变体是采用大肠杆菌的RecA系统,但是RecA重组系统操作复杂,重组效率低。最近建立了Red重组系统,该系统由3个蛋白组成:α蛋白(即λ核酸外切酶),β蛋白,Gam蛋白。应用Red系统进行基因敲除,可以直接利用线性打靶DNA,两侧同源臂长度在35～60bp即可发生同源重组,且重组效率高。关键词:Red重组系统;基因敲除;抗药性基因中图分类号:Q933文献标识码:A文章编号:0253-9772(2003)05-0628-05TheRedRecombinationSystemandItsApplicationtoGeneKnock2outinMicroorganismHUKun1,2,SHIZhao2Xing1,SAIDao2Jian2,HUANGLiu2Yu1(1.BeijingInstituteofBiotechnology,Beijing100071,China;2.CollegeofLifeScienceofShandongNormalUniversity,Jinan250014,China)Abstract:SincemanyDNA2sequencingprojectsofvariedmicroorganismshavebeencompleted,studiesontheirfunctionalgenomicsbecomemoreimportant.Inactivationofaninterestinggeneisadirectmethodtocharacterizeitsfunction.ThoughtheEsherichiacoliRecArecombinationsystemcanbeusedtoproducegenemutants,itneedsacomplexmanipulationpro2cess.Furthermore,itsefficiencyisverylow.RecentlyaRedrecombinationsystemwasdeveloped.Thisrecombinationsys2temconsistsofthreeproteins:αprotein(λexonuclease),βproteinandGamprotein.Inthissystem,thelineartargetingDNAwhichcontainsaselectablemarkerflankedwithahomologousregionasshortasonly35～60bpcanbedirectlytar2getedforgeneknock2outwithahigherefficiency.Keywords:Redrecombinationsystem;geneknock2out;resistantgene自1995年第一个细菌即流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)的全基因组序列被发表以来,已经完成了包括大肠杆菌、痢疾杆菌在内的42种微生物基因组序列的测定。这些全基因组序列的测定为进一步研究各种微生物的基因功能奠定了基础。研究基因功能的重要方法之一是构建基因的突变体来检测其表型的变化,以推测某个基因在生长过程中起到怎样的作用。最直接的方法是将目的基因敲除,这样可以保证被研究的基因完全失活。微生物基因敲除的传统方法是利用微生物本身的RecA重组系统。RecA重组系统是大肠杆菌内源性的同源重组机构,它由RecA和RecBCD组成。RecA蛋白促进各类DNA分子间的同源联会、配对以及链交换和分支迁移。RecBCD分子量较大、是一个由RecB,RecC和RecD组成的复合体,功能多样,是ATP依赖的外切酶V和解旋酶,它与双链切口结合,解开DNA并在Chi位点产生单链DNA,继而由RecA蛋白促进同源重组。由于RecBCD具有核酸外切酶V的活性,所以线性DNA分子在细菌体内会被降解[1],必须要以环形的质粒状态存在才能不被分解。而且必须将靶基因两侧至少200bp的DNA序列克隆至自杀质粒上,并在其中间插入抗药性基因。通过结合转移,依靠RecA同源重组系统将自杀质粒整合于细菌的染色体上。整合于染色体上的自杀质粒又可以发生第二次同源重组,重组的结果会有两种可能:一是把目的基因敲除,通过抗药性基因的筛选,就可以筛选到二次重组子(即基因敲除的缺失突变体);另一种情况是回复为原始的分子状态[2]。利用RecA重组进行的基因敲除为研究微生物基因的功能奠定了重要的技术基础。应用较广的主要有定点突变、变性双链法实...