一、单重Taqman引物探针设计：（为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast中核实一次）1、探针：探针的设计应该在引物的设计之前①长度：18~35（18~30之间最好、最常见），最长37；太长淬灭效果不好。②TM值：PrimerExpress软件计算出来的Tm值在66~72℃之间（最常见68~70℃），最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5~10℃，GC含量在30~80%（最好40%~70%），因此探针最好是富含GC的保守片段；（PrimerExpress：DonotexpandtheTmrangebymorethan2°Cfromthedefaultrange）。③探针位置：尽可能地靠近上游引物,上游引物的3'端离探针的5'端为1-20bp（一般10个以内），最好是探针的5'端离上游引物的3'有1个碱基。④5'端应避免使用碱基G，5'G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在；如果选择FAM-dye在5'端第二个序列也不能为G（Ginthesecondpositiononthe5'endinFAMdye-labeledprobescanreducefluorescentnormalizedreportersignal）。⑤可选：整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。要同时考虑在正反两条链上设计引物与探针。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段，且这个不同的碱基最好在探针的中间，且最好为A或T。⑥Repeatingoligonucleotides：a.避免探针中同一碱基重复过多，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现，即≦3（Avoidrunsofidenticalnucleotides.Ifrepeatsarepresent,theremustbefewerthanfourconsecutiveGresidues.）；b.避免连续的6个A出现（ConsecutiveAresidues：AvoidsixconsecutiveAresiduesanywhereintheprobe.ConsecutiveAresiduescancauseahighNoTemplateControl(NTC)signal）；c.避免探针的中间区域含有2个或以上的CCdinucleotides（AvoidtwoormoreCCdinucleotidesinthemiddleoftheprobe,whichcansometimesreducesignal）。⑦检测探针的DNA折叠和二级结构（最大连续的碱基配对数=4：Maximumnumberofconsecutivebasepairingsallowedinaprimer=4；最大的总的碱基配对数=8：Maximumnumberofbasepairingsallowedinaprimer=8）：a.避免自身形成环状发卡结构（HairpinLoops：IfaDNAstrandpossessesaself-complementarysequence,itmayformasecondarystructure,oftencalledahairpinloop.Whendesigningprimersorprobes,avoidregionsthattendtoformsecondarystructures.Ifsecondarystructuresarepresent,primersorprobesmustcompeteagainstthecomplementarystrandforbindingtothetargetsequence,whichreducesPCRefficiency.），b.避免自身二聚体形成（Self-Dimers：Primersorprobesthatpossess3´complementaritywiththemselvesinthePCRreactionmayformanothertypeofnonspecificproduct,aself-dimer.NonspecificproductformationdecreasesthequantityofspecificproductproducedandmayaddambiguitytothePCRresults.ThePrimerExpress®softwarecalculatesandeliminatesfromconsiderationmostoftheprimersandprobesthatareself-complementaryorpossessstrongself-dimertendencies.），c.避免交叉二聚体形成（Cross-Dimers：Primersorprobesthatpossess3´complementaritywiththemselvesoranotherprimerorprobeinthePCRreactionmayformanothertypeofnonspecificproduct,across-dimer.NonspecificproductformationdecreasesthequantityofspecificproductproducedandmayaddambiguitytothePCRresults.ThePrimerExpresssoftware®calculatesandeliminatesfromconsiderationmostoftheprimersandprobesthatareself-complementaryorpossessstrongdimertendencies.）。⑧可选：3'端的淬灭基团也可以标记在探针的内部核酸上。5'端染料最好连接在T或C碱基上。⑨可选：探针应高度纯化（HPLC）；探针储存液应为100um浓度，工作液为10um浓度并分装25ul/份。⑩反应体系中探针浓度的优化主要依靠背景信号强度、探针与靶的结合效率、PCR扩增的效率、引物的浓度等进行优化。一般探针浓度在0.1~0.4uM范围内进行优化。若用新合成的探针进行优...
