Western Blot 技术原理及常见问题分析2VIP免费

Westernblot技术原理及常见问题分析WesternBlot简介及原理WesternBlot一般流程WesternBlot常见问题分析WesternBlot简介：•印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。•1975年，Southern将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段，称为Southern印迹法。•而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。WesternBlot基本原理WesternBlot优点高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlot应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析WesternBlot流程蛋白样品的制备•SDS-PAGE•转膜•封闭•一抗杂交•二抗杂交•底物显色蛋白样品的变性•2×SDS-PAGE上样缓冲液：•DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。•按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～50μg。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚蓝0.2g总体积100ml①100mMTris-HCl(pH6.8)②200mMDTT③4%SDS④0.2%溴酚兰⑤20%甘油⑥ddH2OSDS(十二烷基硫酸钠)：•阴离子去污剂变性剂•氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。•蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。•与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。不连续的电泳缓冲体系。SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳Hoeher电泳系列凝胶成分丙烯酰胺和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺神经毒素！SDS配胶的Tris缓冲液TEMED神经毒素！过硫酸铵(AP）神经毒素！Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶(5%Acrylamide)及分离胶配方表：http://bbs.bbioo.com/thread-20726-1-1.html灌制分离胶隔绝空气ddH2O0.1%SDS:<8%异丁醇：>8%灌制浓缩胶插入梳子浓缩胶分离胶样品加样槽蛋白质分子的迁移方向123M电泳之后凝胶染色扫胶DNRBIS910凝胶成像系统注意：做westernblot通常用预染maker！转膜•要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。•常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。转移膜的选择•最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。•各种膜的详细特点介绍：•http://www.bbioo.com/bio101/2008/21461_2.htm湿转系统注意事项：1.胶在负极，膜靠近正极2.保证每层之间没有气泡3.转膜过程产生大量热量，需冰浴夹板海绵滤纸凝胶膜滤纸海绵正极负极Hoefer全能型转印系统半干转印系统Hoefer半干转印系统注意：防止短路！转膜后检测（此步可以省略）丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。封闭作用：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。封闭剂：5%脱脂奶粉或BSA，或3%明胶溶于TBSTWesternBlot膜封闭液（生物试剂公司）室温孵育1h或4℃过夜注：Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。一抗、二抗孵育1.把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃...