核酸提取及琼脂糖电泳VIP免费

核酸提取及琼脂糖电泳核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。DNA提取的几种方法染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它基因组DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。基因组DNA－CTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方20mMEDTA（pH8.0）0.1%（V/V）使用前加入2%(W/V)1.4M100mM终浓度β-巯基乙醇CTABNaClTris-HCl（pH8.0）组份20mMEDTA（pH8.0）0.1%（V/V）使用前加入2%(W/V)1.4M100mM终浓度β-巯基乙醇CTABNaClTris-HCl（pH8.0）组份Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除CTAB提取缓冲液的改进配方5%(W/V)PVP4020mMEDTA（pH8.0）2%（V/V）使用前加入3%(W/V)1.4M100mM终浓度β-巯基乙醇CTABNaClTris-HCl（pH8.0）组份5%(W/V)PVP4020mMEDTA（pH8.0）2%（V/V）使用前加入3%(W/V)1.4M100mM终浓度β-巯基乙醇CTABNaClTris-HCl（pH8.0）组份PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－SDS法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法原理SDS法DNA提取缓冲液20mMEDTA（pH8.0）2%0.4M10mM终浓度SDSNaClTris-HCl（pH8.0）组份20mMEDTA（pH8.0）2%0.4M10mM终浓度SDSNaClTris-HCl（pH8.0）组份SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－其它方法根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法：•硅质材料•阴离子交换树脂•磁珠高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。浓盐法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物基因组DNA－其它方法DNA提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备基因组DNA的提取最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：•植物材料－－液氮研磨•动物组织－－匀浆或液氮研磨•组培细胞－－蛋白酶K•细菌－－溶菌酶破壁•酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取核酸分离、纯化基因组DNA的提取采用吸附材料吸...