虫草素抑制内质网应激引起的肾小管上皮细胞凋亡及机制探讨VIP免费

中国医科大学博士学位论文虫草素抑制内质网应激引起的肾小管上皮细胞凋亡及机制探讨姓名：张卉申请学位级别：博士专业：临床医学；内科学指导教师：张玉侠201203·中文论著摘要·虫草素抑制内质网应激引起的肾小管上皮细胞凋亡及机制探讨内质网(endoplasmicreticulum，ER)是细胞中组装蛋白质的重要细胞器，具有合成胆固醇、脂质、激素等的功能。遗传信息通过核糖体翻译后形成一级结构的蛋白质，在内质网中进行折叠，形成特殊的空间构象，从而形成具有成熟功能的蛋白质。内质网中内环境的稳定是其发挥功能的基础。未折叠或错误折叠的蛋白质不能通过内质网分泌，并在内质网中聚积，引起内质网应激(ERstress，ERS)，并引发未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse，UPR)。很多病理生理过程，如缺氧、氧化应激、营养缺乏、细胞内钙紊乱等都可以引起内质网应激。当ERS超过UPR的清除能力，细胞便走向凋亡。目前的研究报道，神经系统疾病、糖尿病、代谢性疾病、病毒感染、药物引起的组织损伤及缺血缺氧等都和ERS有着密切的关系。肾脏很容易受缺氧缺血，炎症因子及药物等的毒性作用，引发各种类型的肾脏疾病。在肾脏病的发展过程中，高血压、高血糖、高血脂、蛋白尿、同型半胱氨酸血症等并发症也是ERS的诱导因素，持续存在的ERS将引导细胞走向凋亡。自噬是真核细胞中重要的病理生理过程，在正常状态下，自噬维持在一个很低的水平。在饥饿、应激、生长因子缺乏等情况下可激发细胞自噬。细胞内游离的双层细胞膜结构包裹细胞内的物质形成自噬体，然后和溶酶体融合，并使其中的物质降解，提供能量。有许多研究表明ERS可以引发细胞自噬，其机制并不明确，细胞内蓄积的蛋白质主要通过特异性泛素酶系统和非特异性细胞自噬来降解，ERS引发自噬可能是由于蛋白质蓄积本身引发的细胞自身调节机制，也可能由于ERS时，UPR通过一些分子通路激活自噬的过程。目前，ERS引起自噬的意义也存在争议，有报道称自噬可清除细胞内蓄积的蛋白质，促进细胞存活，也有报道发现过度的自噬可以引起细胞程序性死亡，在ERS诱导下加用自噬抑制剂可以减少细胞的凋亡，这也许和细胞种类以及ERS的程度，时间有关。mTOR是调节自噬始动阶段的重要分子，其上游的AMPK、Aid等分子通路是否都和自噬的发生相关，其中是否有ERS可以激活的通路仍不明确。虫草素(Cordycepin／37-deoxyadenosin,3·DA)自1975年由GaryM在(Nature))上首次报到后，其研究一直没有成为热点，且一直局限在抑制基因转录的和抑制肿瘤细胞生长等方面。在我国，冬虫夏草是十分名贵的中草药，很多中成药含有冬虫夏草的提取物，临床应用也有较好的疗效。肾脏病的治疗中也用到了这种中成药作为辅助治疗，如百令胶囊、心肝宝等，在减轻蛋白尿、调节机体免疫力方面有一定的疗效，但其机制却不明确。近年来，我们研究发现，虫草素可以阻断UPR中促凋亡通路：IRE-JNK通路，增强促存活通路：PERK-elF2a通路，抑制ERS引起的细胞凋亡。还有研究发现mTORCl可以增强IRE．．INK通路促进ERS引起的凋亡。此外，虫草素的其他生物学功能还有待进一步研究。本研究为明确内质网应激对肾小管上皮细胞的影响，以及虫草素的作用设计了以下实验：1、利用内质网应激诱导剂培养大鼠肾小管上皮细胞，诱导内质网应激，并观察细胞的凋亡情况。探讨内质网应激在肾小管上皮细胞中的作用；2、在大鼠肾小管上皮细胞中，诱导内质网应激，观察细胞内自噬的情况。探讨内质网应激对自噬的影响。利用自噬抑制剂阻断自噬，探讨自噬在内质网应激诱导凋亡中的作用；3、在内质网应激条件下，利用虫草素培养大鼠肾小管上皮细胞，观察细胞凋亡、自噬以及蛋白质S6K、AMPK和Akt的磷酸化情况。探讨虫草素在抑制细胞自噬、凋亡中的作用，以及可能的分子通路。一、内质网应激诱导肾小管上皮细胞凋亡目的：利用内质网应激诱导剂培养大鼠肾小管上皮细胞，诱导内质网应激，并观察细胞的凋亡情况。探讨内质网应激在肾小管上皮细胞中的作用。方法：1、大鼠肾小管上皮细胞(N】[Ⅸ52E)内质网应激的确定。用不同浓度Tunicamycin(Tm)和Thapsigargin(Tg)刺激NRK52E细胞，或用Tm和Tg在不同时点刺激NRK52E细胞。培养结束后，用Nor...