原位杂交技术VIP免费

原位杂交技术2012-12-06原位杂交技术一一原位杂交技术的历史发展二原位杂交技术的原理及分类三原位杂交技术的一般过程四原位杂交技术的应用一、原位杂交技术的历史发展原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。二、原位杂交技术的原理及分类概念：原位杂交技术(Insituhybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。分类1、基因组原位杂交技术基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。2、荧光原位杂交技术荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。3、多彩色荧光原位杂交技术多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术，它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩。4、原位PCR原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。三、原位杂交技术的一般过程以经过标记的已知核酸分子为探针以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交再对其探测探针标记靶核酸分子杂交检测一）、探针是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上1、cDNA2、RNA3、寡核苷酸1、cDNA(complementaryDNA)互补于mRNA的DNA分子（长度为数百-数千碱基对）⑴克隆于质粒中，可以无限繁殖，取之不尽⑵较稳定，不易被降解⑶标记方法可靠易行优点优点：⑴杂交效率比DNA探针高⑵在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定⑶可以同时得到同义RNA链和反义RNA链缺点：2、RNARNA是单链分子（探针长度50-300碱基对）容易受容易受RNARNA酶的污染而被降解酶的污染而被降解这类探针是根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上用化学方法合成优点：形成杂交体快速（序列短链，杂交时易于穿透）缺点：特异性较低（短链和简单）•短链探针•(长度10-50个核苷酸)•短链探针•(长度10-50个核苷酸)3、寡核苷酸二）、探针标记1、标记物（1）放射性标记物（2）非放射性标记物2、标记方法（1）DNA探针标记（2）RNA探针标记（3）寡核苷酸探针标记1、标记物①高度灵敏性；②标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模板的结合能力及结合的特异性；③当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；④高度特异性；⑤较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；⑥对环境无污染，对人体无损...