蛋白质层析技术VIP专享VIP免费

蛋白质层析技术导言•生物技术有三大部分：生化分离技术；DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。其中生化分离技术是生物技术的基础和支柱。•层析是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。•基因工程下游的核心是层析。•层析技术的理论和实践已高度发展和完善。蛋白质结构组计划•目标：用十年的时间获得一万种蛋白的三维结构。•但是只有57%被克隆的蛋白能够成功表达。•而且在这些表达的蛋白中，只有28%的重组蛋白能够被纯化出来。•最终，只有2%-10%的最初的目标蛋白被成功的建立。蛋白质层析分离纯化机制•电荷不同：离子交换层析•大小、形状：凝胶过滤层析•疏水区域：疏水层析•特异性：亲和层析（选择性是最优秀的）层析介质•生物兼容性：亲水性，大孔径，不会使生物大分子失活，没有生物化学毒性—过强吸附、泄露。•化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的。•必要的机械性能：流体中的耐压性、弹性。化学组成：亲水多孔高聚物等亲水的介质对蛋白有吸附作用，因此要在层析溶液中加一定浓度的盐。聚合物机体孔的结构结构：典型层析介质的放大观察孔的结构可分为三种类型整体柱（monolithiccolumn）•概念：它是由单体、引发剂、致孔剂等混合物通过原位制备而成一个棒状整体,具有制备方法简单、内部结构均匀、重现性好、具有较高的柱效和可进行快速分离等优点,已在反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、体积排阻色谱中获得了应用,并成功分离了肽、蛋白质、类固醇、芳烃、聚合物、低聚核苷酸、氨基酸等物质。整体柱（monolithiccolumn）•大孔结构平均孔径为2μm的大孔网络，允许流动相快速通过，反压极低，从而大大降低了分离时间。•中孔结构大量孔径为13nm的“中孔”，保证了目标分子在色谱分离过程中吸附/解吸附作用所需的表面积，因此，整体化色谱柱可以在高流速时保持高柱效。整体柱（monolithiccolumn）•高流速整体化色谱柱的总孔率约80％，填料具有优越的渗透性，即便使用高流速进行色谱分离，柱压也很低；基本不会因脏的样品而受堵，寿命长。•高柱效整体化色谱柱的柱效和3.5μm粒径的颗粒型色谱柱相当，而大大优于5μm粒径的色谱柱。并且，整体化色谱柱在流速升高时，柱效下降程度低。整体柱（monolithiccolumn）•目前,商品化的聚合物整体柱有CIMTM,硅胶整体柱有SilicaRODTM和PrepRODsTM。•默克整体柱ChromolithTM蛋白质纯化平台纯化平台的硬件结构•中心设备：中压至高压层析仪•辅助设备：过滤装置，超滤装置，离心机，蛋白质电泳等蛋白质纯化平台的结构和组成•含量较高的蛋白质纯化，基本可以在三个层析步骤中实现。•用目标蛋白的三个独立的物理化学性质进行层析分离。几步完成纯化？综合考虑样品的各种性质稳定性（PH值，活性）疏水性分子大小，形状。关键辅助因子•关键杂质•产品浓度•引进污染物•产品纯度•单位成本•产量设计合理的方案•各种机制交替试用，相互衔接、补充。（3步）•分辨率：疏水层析<离子交换层析•载量：疏水层析<离子交换层析•选择性：疏水层析>离子交换层析同样的起始样品不同的纯化方案通常纯化流程：选择性>分辨率>载量•目标蛋白为碱性蛋白，在中性附近运用阳离子交换，选择性好，除核酸多糖；•目标蛋白为酸性蛋白，则第一步层析采用分子筛，最好此前将溶液脱盐，并在含０.２-０.４MNaCl的缓冲液中运行，缓冲成分视下一步而定。•如果介质含聚丙烯酰胺，则应含Tris等含氮的缓冲成分，减少π-π互相作用造成的吸附.梯度洗脱还是分步洗脱•蛋白质层析因为保留值差别很大，比如相差1000倍，这样能够洗脱的唯一方法就是强度递增的洗脱——阶段洗脱或连续梯度洗脱样品通常特点及对后续纯化的影响•大多数蛋白将带负电荷，样品会含一定量核酸；•运行层析，则蛋白浓度不应大于10mg/ml。•(NH4)2SO4沉淀，通常蛋白浓度1-5mg/ml.平台的操作（软件：知识结构）•样品处理及准备工作•用SDS-PAGE监测整个流程•富含目标蛋白的提取物的获得：应采用尽量低强度的抽提方法。•通常PBS或TBS抽提能力过强，没有必要.低渗更有利于破碎，甚...