热应激对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞HSP70mRNA表达量的影响_赵丽红VIP免费

摘要选取健康的泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织，放入含双抗的D-hank′s液带回实验室，经胰酶消化法获得奶牛乳腺上皮细胞，用铺有鼠尾胶原的六孔板对获得的奶牛乳腺上皮细胞进行体外培养，接种密度为1×106个/mL，培养液成分为DMEM/F12，胎牛血清，胰岛素，转铁蛋白，表皮生长因子，谷氨酰胺，双抗等。对细胞进行原代培养，收集贴壁48h时的细胞培养液，对细胞β-酪蛋白的分泌特性进行检测，鉴定贴壁的细胞是否为奶牛乳腺上皮细胞。细胞贴壁48h后，分两组对细胞进行热应激处理。第一组为单一高温处理法：将37℃正常培养的乳腺上皮细胞放置于38℃、39℃、40℃、41℃恒温水浴锅中，热处理1h后立即放回37℃、95%湿度、5%CO2环境中恢复培养，在恢复培养0h、6h、12h、24h收集细胞样品，-70℃冻存。第二组为连续高温处理法，每隔24h对乳腺上皮细胞进行一次高温处理，38℃、39℃、40℃、41℃恒温水浴，方法同前，在每个热处理后24h收集细胞样品，连续收集3d，-70℃冻存。提取细胞总RNA，经反转录、RT-PCR、凝胶电泳、回收、与pGEM-T载体连接、转化、摇菌、提质粒、酶切、测序、倍比稀释等步骤制备HSP70和GAPDH标准质粒，然后RealtimeRT-PCR制定标准曲线，定量测定不同热应激处理的样品当中HSP70mRNA的表达量。经Western-blotting检测，原代培养贴壁的细胞为奶牛乳腺上皮细胞。热应激处理后，HSP70mRNA的表达量与温度呈正相关。且单一热应激处理后，在恢复培养第6h时HSP70基因的表达量最高；第12h组与24h组差异不显著（P﹥0.05），这两组皆与0h组差异显著(P﹤0.05)，与6h差异极其显著(P﹤0.01)。说明单一热应激恢复培养后12h-24h细胞基本恢复正常状态，热应激反应逐渐消失。连续高温处理法显示，细胞热应激第48h组HSP70mRNA表达量显著高于24h组（P﹤0.05）,但72h时HSP70mRNA表达量有所降低。说明细胞在连续热应激的过程中细胞损伤较大，连续热应激后的恢复期延长。另外，连续热应激后，细胞HSP70mRNA表达量有所下降，说明细胞可能产生了热耐受性。热应激对奶牛影响极其严重，严重的热应激可使高产奶牛产奶量下降80%，给奶牛养殖小区造成了巨大的损失。本文旨在对奶牛热应激的原理在分子领域进行探索，研究高温应激对奶牛乳腺上皮细胞的损伤机理，为进一步的进行热应激的营养调控提供理论基础。原代培养的奶牛乳腺上皮细胞在细胞种类、细胞性状、细胞结构与细胞功能上与体内来源细胞有着极大的相似性，又可以在培养过程中进行处理，以消除其它因素的影响，为研究提供了快捷和便利。关键词：原代培养；HSP70；RealtimeRT-PCR；热耐受性；乳腺上皮细胞TheEffectofHeatStressontheHSP70mRNAExpressionofCulturedDairyCattleMammaryEpithelialCellAuthor:ZhaoLi-hongTutor:LiJian-guoMajor:AnimalNutritionandFeedScienceAbstractSelecthealthylactatingmammaryglandofHolsteincows,putitintotheD-hank'ssolutionwithdouble-antibody,takebacktothelaboratory.weobtainedthemammaryepithelialcellsbytrypsindigestion,andcultureditinthesixorificewhichcoveredwithrattailcollagen.Theinoculationdensitywas1×106/mL.CulturemediumcomposedofDMEM/F12,fetalbovineserum,insulin,transferrin,epidermalgrowthfactor,glutamine,doubleanti-so.Collectedthecellmediumaftercultureed48htoidentifyofwhetherthecellsweremammaryepithelialcells.Afterthecellsadhered48h,dividedintotwogroupsandheattreatment,respectively.Thefirstgroupdealedwithasinglehigh-temperatureprocessing:putthe37normalcultured℃mammaryepithelialcellsin38,39,40,41waterbathpot,immediately℃℃℃℃replaceitintothe37,℃95%humidity,5%CO2environmentforcultivationafterheated1hour.Attheresumptionofcultured0h,6h,12h,24htocollectcellsamples,-70cryopr℃eservation.Thesecondgroupdealedwithcontinuousheattreatment,every24hdoahightemperaturefor1h,38,39,40℃℃,41waterbath,t℃℃hesamewayasbefore,after24heachtreatmenttocollectcellsamples,continuouscollected3days,-70cryopreservation.Extractionoftota...