琼脂糖凝胶电泳VIP免费

DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测一、实验原理电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段的最常用技术。当制备好的一块“胶”即一块包含电解质的多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷的磷酸根残基。•当DNA/RNA长度增加时，来自凝胶的阻力就会增加，不同长度的DNA/RNA片段就会出现不同的迁移率。因而就可依据DNA/RNA分子的大小使其分离。分离长度凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳200bp—近50kb聚丙烯酰胺凝胶电泳5—500bp分辨率高•采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子。含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围凝胶中的琼脂糖含量[%（W/V）]DNA/RNA分子的分离范围（kb）0.35—600.61—200.70.8—100.90.5—71.20.4—61.50.2—320.1—2EB染料•溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。电泳缓冲液的组成1.Tris—乙酸（TAE）2.Tris—硼酸（TBE）3.Tris—磷酸（TPE）其浓度约为50mmoL/L，PH为7.5—7.8,这些缓冲液均含有EDTA。这些缓冲液通常配制成浓缩液，贮存于室温。常用的电泳缓冲液的配制缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris—乙酸（TAE）1×：0.04moL/LTris—乙酸0.001moL/LEDTA50×：242gTris碱57.7mL冰乙酸100mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)Tris—磷酸（TPE）1×：0.09moL/LTris—磷酸0.002moL/LEDTA10×：108gTris碱15.5mL85%磷酸40mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)Tris—硼酸（TBE）0.5×0.045moL/LTris—硼酸0.001moL/LEDTA5×：54gTris碱27.5g硼酸20mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)加样缓冲液缓冲液类型6×缓冲液贮存温度I0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液4℃II0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖水溶液室温III0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液4℃IV0.25%溴酚蓝40%（W/V蔗糖水溶液）4℃V（碱性加样缓冲液）300mmoL/LNaoH6mmoL/LEDTA18%聚蔗糖水溶液0．15%溴甲酚绿0．25%二甲苯青FF4℃•加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。•溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。DNA片段长度标记•DNA片段长度标记通常叫作DNAMarker,本实验使用GeneRulerTMDNALadderMix为DNA片段长度标记，分别由100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1031bp、1200bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp、10000bp组成，DNAMarker不仅可以作为凝胶中DNA片段长度的一个标记，还可以作为电泳的对照。二、实验方法•1．50×TAE的稀释：如制备50mL1×TAE，取1mL50×TAE加入49mL水定容至50mL。•2．制备1%的琼脂糖胶液：取0.2g琼脂糖溶于20mLTAE中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至60.(℃加入浓度为10mg/mL的EB2μL，使EB的终浓度为1μg/mL)。•3．用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用DEPC—SDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。•4．用胶带封住胶床，放好梳子。•5．将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固20—60min。•6．在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。•7．向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。•8．分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入加样孔。•9．正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为50mA。•10．电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。三、注意事项与实验技巧•制胶和加样过程中要防治气泡的产生。•紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。•EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。•加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，...