对流免疫电泳VIP免费

医学免疫学第二次实验制作者：蒋继昌实验目的•掌握对流免疫电泳技术的原理和方法•巩固电泳槽、电泳仪的使用方法•提高对抗原、抗体免疫反应的理解实验原理•本实验是基于抗原抗体的等电点彼此不同，在通电的琼脂凝胶中抗体向负极，抗原向正极相对电泳而设计的。一般抗体（IgG）的等电点为pH5~9，血清蛋白抗原的等电点为pH4~5，在pH8.2~8.6的缓冲溶液中，抗体所带负电荷较少，正电荷较多，而且分子在直流电场中易受溶液中负离子的吸引作用及溶液的电渗作用而向负极迁移；在同样条件下，抗原所带正电荷少，负电荷多，分子也较少，电泳迁移快，虽也受电渗影响，但仍向正极泳动，若抗原抗体相对应，则在两者相遇于最适比例处形成沉淀，此即为对流免疫电泳的阳性结果。特点•该法为一种定性实验，其应用双向琼脂扩散试验，其实际是在前者的基础上加电泳的方法，由于抗原抗体在电场下定向运动限制了抗原、抗体的扩散倾向，故能增加抗原、抗体的局部浓度及加快它们相遇的速度，从而提高试验的敏感性和缩短反应时间，有快速检测的特点。并且该方法成本低廉。实验材料1、正常人血清（抗原）2、兔抗人血清（抗体），等电点：8.03、0.05UpH8.6巴比妥-盐酸缓冲液、生理盐水4、1%离子琼脂板（用0.05U巴比妥-盐酸缓冲液配浇成）5、打孔器，图样板，毛细吸管6、电泳仪，电泳槽实验方法1.制备离子琼脂板，按右图在琼脂板中打孔挑出孔中琼脂，孔径3mm，每组孔距3mm。2.在正极的小孔加入已知抗人血清，靠近负极端小孔加入人血清，同时作生理盐水对照孔。3.用毛细吸管按图滴加抗原、抗体。4.加样完毕后，将琼脂板放入盛有0.05UpH8.6巴比妥-盐酸缓冲液的电泳槽内，用浸湿的滤纸片将离子琼脂板的两端与电泳槽内的缓冲液相接。5.将电泳仪与电泳槽接通，开启后，调整电压为30V，电流强度为6~8mA，通电约1h。6.取出琼脂板，在黑色背景处，多个角度观察结果。抗原与抗体间出现一条白色沉淀线为阳性。若沉淀线不清楚，于37℃环境中存放数小时可增强沉淀线清晰度。流程图观察结果电压30V，电流强度6~8A，电泳1h①孔加入兔抗人血清，②孔加入人血清，③孔加入生理盐水制板注意事项•1.加样时不要起泡，勿溢出琼脂孔。•2.抗原、抗体的量应相接近，如抗原过多，可造成假阴性结果，须通过稀释抗原加以解决。•3.电泳时电压不宜过高或过低，过高可能会将琼脂拉断；过低时沉淀线出现的时间会延长。