苏州医学院学报2000;20(1)39朱华亭刘继明殷昌硕张学光(苏州医学院免疫学研究室,苏州,215007)摘要目的为了建立一种快速而灵敏的蛋白质检测方法。方法在考马斯亮兰法测定蛋白质含量时,通过采用590nm和450nm双波长代替单波长检测,并以酶标检测仪取代紫外-可见分光光度计作为检测仪。结果此种改进不但提高了考马斯亮兰法检测蛋白质的灵敏度(0.127μg/ml)和检测范围(0.127～31.25μg/ml),而且使大量标本的检测可在一次检测过程中完成。标准直线相关系数r2=0.9965,表明在检测限内A595/A450和蛋白质浓度C呈良好线形关系。结论双波长法可作为一种快速、敏的蛋白质检测方法。关键词蛋白质;定量;双波长;考马斯亮兰中图法分类R392-33RapidTwo-colorimetricAssayforProteinQuantitiesZhuHuating,LiuJiming,YinChangshuo,etal(DepartmentofImmunologySuzhouMedicalCollege,Suzhou,215007)AbstractObjectiveToimprovethesensitivityoftheCoomassiebrilliantblueproteinassay.MethodsTheCoomassiebrilliantblueassayisaccomplishedbymeasurementofabsorbanceat590and450nm.Tolinearwithproteinconcentrationbytheratiooftheabsorbance,590nmover450nm,toreaderasthedetectingequipment.ResultsThissimpleprocessincreasestheaccuracyandimprovessionsThisassaycanbeassensitiveandrapidamethodforproteinquantities.KeywordsProteinquantity;two-colorimetric;Coomassiebrilliantblue考马斯亮兰蛋白质定量法,也被称为Bradford本,能减少系统误差。本实验拟用双波长代替单波测定法[1]。该方法具有易开展,快速和对蛋白质特长,并用酶标仪代替紫外-可见分光光度计提高检异性好,所以被广泛用于蛋白质的测定[2]。但该方测灵敏度。法也有其局限性,首先其检测灵敏度较低,只能检测mg级水平的蛋白质;其次,考马斯亮兰检测的线性1材料和方法范围窄,在2～10μg/ml之间[3]。鉴于其有上述缺1.1试剂:考马斯亮兰G-250和结晶牛血清白蛋点,是否能通过方法上的改进,拓展考马斯亮兰法的白(购自Sigma)。其它所用试剂为分析纯,去离子应用范围。在酸性条件下,考马斯亮兰染料呈红色,双蒸水作为溶剂。[2]亮兰染料和考马斯亮兰-蛋白质结合物有不同的吸50ml95%乙醇中,再加入100ml的浓磷酸(85%光系数。传统考马斯亮兰法利用考马斯亮兰-蛋白W/V),最后加蒸馏水至200ml,此染料于4℃避光结合物最大吸收波长595nm时的吸收度A来反映可存放6个月。临用前1∶稀释。蛋白质的浓度,而忽略了游离考马斯亮兰染料在此1.3吸收光谱测定:将染料1∶稀释并过滤,在干波长下也有一定的吸收度。在ELISA检测和MTT净试管内加入0.8ml稀释好的染料,再加入0.2ml测定中,常利用双波长法来消除杂吸收的影响从而的待测样本,对照品为蒸馏水,反应时间至少5min,提高检测的灵敏度[4]。酶标仪可一次检测大量标但不超过30min。用紫外-可见分光光度计(上海双波长法快速测定蛋白质含量3butnottheabsorbanceof590nm,andreplacetheUV/VISspectrophotometerwiththemicroplateau2thesensitivityoftheassayabout20-fold,alsomakealotofsamplesbedetectedinonecycle.Conclu2而当它与蛋白质结合时变成兰色。因此考马斯1.2染料的配制:将100mg考马斯亮兰溶解在灵553国防科技预研项目(Y5573162)40分光光度计厂,752C)在460～700nm波长内,每10nm检测样品的透光率,换算成吸收度,根据吸收度-波长绘制吸收光谱图。1.4蛋白质测定:方法同上,样品和染料用量减少1/4。用酶标仪(Bio-Rad,model550)代替紫外-可见分光光度计作为检测仪,酶标检测板作为反应池,检测特定波长下不同蛋白浓度产生的吸收度。2结果2.1吸收光谱:0.8ml稀释的染料加入0.2ml5mg/ml的牛血清蛋白,使考马斯亮兰完全与蛋白结合,在360～700nm内每相隔10nm检测待定样品的吸收度。根据吸收度-波长绘制考马斯亮兰-蛋白质结合物吸收光谱(图la);以稀释的染料为待测样本,绘制游离考马斯亮兰染料的吸收光谱(图lb)。ACTAACADEMIAEMEDICINAESUZHOU2000;20(1)从吸收光谱图可知,考马斯亮兰-蛋白质结合物的最大吸收波长为590nm,考马斯亮兰染料的最高吸收波长为460nm,590nm波长下游离考马斯亮兰染料也有较高的吸收度,而460nm处染料-蛋白质结合...
