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StratageneMx3000p操作手册StratageneMx3000P荧光定量PCR仪应用手册上海吉泰生物科技有限公司2005-09-08上海吉泰生物科技有限公司PCR反应原理上海吉泰生物科技有限公司目录第一章聚合酶链反应原理..................................................1第二章荧光定量PCR技术原理..............................................5第三章样本及标准品处理..................................................9第四章系统主要组成及工作原理..........................................11第五章系统的适用范围和性能.............................................12第六章系统的安装........................................................14第七章程序设置及运行....................................................16第八章系统的维护及注意事项.............................................18第九章常见故障及排除....................................................20第十章吉泰生物科技有限公司售后服务承诺书.............................22PCR反应原理第一章聚合酶链式反应原理聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、灵敏度高、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段在数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。一、PCR技术的基本原理PCR反应类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。1、PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。理论上平均扩增效率的为100%，但在实际反应中扩增效率达不到理论值,这是由于在反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，但随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台效应。大多数情况上海吉泰生物科技有限公司1PCR反应原理下，平台期的到来是不可避免的，到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。2、PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，...