植物蛋白质的提取和含量测定VIP免费

植物蛋白质的提取和含量测定一、实验目的掌握大豆蛋白的提取及制备大豆蛋白丙酮干粉的方法。二、实验原理1.大豆蛋白主要是酸性蛋白，pI4.5-5.0，能溶于碱溶液本实验先利用稀碱提取大豆蛋白，再利用丙酮结合等电点溶解度最低原理沉淀蛋白。2.Folin-酚法测定蛋白质含量酚试剂由两部分组成，试剂A为双缩脲试剂，可与肽链发生显色反应，试剂B中的磷钼酸和磷钨酸在OH-条件下不稳定，易被酚类化合物还原显蓝色，因蛋白质中含Tyr被还原成蓝色，颜色深浅与浓度成正比，可用比色法测定。三、实验器材1.分光光度计（500nm），比色皿2.计算纸（9cm×9cm）3.离心机（离心管100ml、50ml）4.组织捣碎机5.精密pH试纸pH0.5-5.0;pH4.5-7.0四、实验试剂1.大豆干粉2.0.2%NaOH3.丙酮（预冷）4.6MHCl，1MHCl5标准BSA（0.5mg/ml）6.Folin—酚试剂甲（用前组分一:组分二=50:1）（1）1克Na2CO3和0.2克NaOH溶解于50毫升蒸馏水中。（2）0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解100毫升1%酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）中。每次使用前，将50ml（1）与1ml（2）混合，即为试剂甲。四、实验试剂7.Folin—酚试剂乙（用前稀释一倍）在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4•2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。五、实验步骤（一）蛋白提取1.称取3克大豆干粉，加入0.2%NaOH30毫升。（先加入调成糊状，再用少量多次地慢慢地加入（边加边搅拌），室温下搅拌抽提10min，于4000r/min离心7min,小心留取上清液，弃脂层和沉淀，如上清液有漂浮物，再经过滤；2.留出上清液2毫升稀释50倍做含量测定（第二步）3.制干粉：量剩余上清液的体积，加入等体积预冷丙酮，先用6mol/L的HCl调pH至6.0，再用1mol/L的HCl小心调pH至4.5-5.0，于4000r/min离心15min，(留取沉淀物)，并用少量丙酮反复(至少两次)搅拌洗涤（在离心管中进行），加入丙酮后一定将沉淀搅拌充分，使沉淀脱水。得到白色粉末状的大豆蛋白粉，用干净的滤纸吸干、平铺在表面皿上，放入40度烘箱干燥，待整个实验结束后，再称重并计算产率（即3克大豆干粉中蛋白含量）。五、实验步骤（二）蛋白含量测定1.制作标准曲线按照下表操作，以A500nm为纵坐标，以蛋白含量为横坐标建立标曲。2.测定提取第2步稀释后样品的蛋白浓度按上表中样品列操作，根据A500nm查找含量，并计算原始浓度。试管试剂ml123456样品标准BSA蒸馏水0.00.10.20.30.40.50.50.40.30.20.10.00.1(稀释50倍后)0.4Folin—酚试剂甲各4ml4ml混匀后静置10minFolin—酚试剂乙各0.5ml0.5ml混匀后静置30minA500nm0.000